旋毛虫P49和P53ES抗原基因的真核表达

将构建的重组质粒pEGFP-N1-P49和pEGFP-N1-P53同时进行双酶切,回收P53基因片段和pEGFP-N1-P49载体,再将P53基因片段重组到pEGFP-N1-P49中,构建旋毛虫ES抗原P53和P49融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-P49-P53,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7。于转染后第24小时在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的转基因细胞;Western-blot分析证实目的基因的表达产物具有抗原性。结果表明,成功构建了含有旋毛虫ES抗原P53和P49融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-P49-P53,并在COS-7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。     

禽呼肠孤病毒σA基因对鸡胚成纤维细胞天然免疫相关基因转录水平的调控影响

为了明确禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σA基因对宿主天然免疫应答的影响,本研究利用实时荧光定量PCR方法检测pCAGEN-σA转染鸡胚成纤维细胞(DF1)后,不同时间点(转染后第3、6、12、24和36小时)DF1细胞中天然免疫相关基因,包括Toll样受体(TLRs)、MDA5、MAVS、My D88、TRIF、IRF-3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IFITM3、Mx1和OASL等基因的转录水平变化。结果,与空载体转染细胞相比,pCAGEN-σA转染细胞中上述这些天然免疫基因的m RNA水平出现不同程度变化(P0.05或P0.01)。TLR3应对最快速,其m RNA水平在转染后第3小时和第6小时迅速上升,但9 h后逐渐下降;MDA5和TLR7的m RNA水平,则分别在转染后第6小时和第12小时开始显著升高,并分别在转染后第12小时和第36小时达到峰值(P0.05或P0.01);TLR15的m RNA水平整体变化不明显。My D88和MAVS的m RNA水平呈表达上调趋势;TRIF在转染后第6小时表达量迅速达到峰值(2.83倍),随后急速下降。NF-κB呈表达上调趋势;而IRF3/7的表达则被抑制。I型干扰素(IFN-α和IFN-β)呈现相似的表达模式,在转染后第6小时和第24小时表达量增加,其他时间点均为表达量下降; IL-6和IL-8则表达上调,分别在转染后第9小时和第6小时达到峰值(P0.01)。IFITM3、Mx1、OASL的m RNA水平也显著升高,均在转染后第12小时达到峰值(P0.01)。上述试验结果表明,在DF-1细胞中过表达σA基因,能显著引起天然免疫相关基因的表达的变化,为进一步阐释ARV的分子致病机制和免疫应答机理奠定了基础。     

二甲双胍对水疱性口炎病毒的抑制作用及其机制的初步研究

为探讨二甲双胍（Metformin）对水疱性口炎病毒（VSV）复制的影响及其作用机制,笔者利用CCK-8法检测不同浓度Metformin对PK-15细胞活力的影响,同时利用RT-qPCR、Western-blot等技术分析Metformin对病毒复制、细胞因子表达及其作用途径的影响。结果显示,当Metformin的浓度达到10 mmol/L时,细胞的存活率仍接近100%。与未处理的感染细胞组相比,Metformin显著抑制VSV在PK-15细胞和Vero细胞中的复制。进一步的研究发现,Metformin通过激活AMPK、抑制m TOR进而诱导自噬,同时抑制IFN-β、IL-6和TNF-α的表达;敲低自噬关键基因ATG7抑制VSV的复制,并促进IFN-β表达。本研究证实Metformin抑制VSV复制,丰富了Metformin影响病毒复制的网络信号,为病毒病有效防控提供重要的科学依据。     

小鼠Ghrelin基因真核表达质粒的构建及对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

为构建小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒,并研究Ghrelin对3T3-L1细胞增殖的影响,以小鼠肠cDNA为模板,通过PCR扩增Ghrelin基因,插入到pMD18-T克隆载体中。对经鉴定的重组质粒pMD-Ghrelin进行双酶切,将目的基因连接到经同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用Lipofectamine 3000转染试剂将重组表达质粒转染到3T3-L1细胞中,采用qRT-PCR和Real-time PCR检测Ghrelin基因在3T3-L1细胞中的表达。采用CCK-8法检测细胞的生长活力;流式细胞术检测Ghrelin基因对细胞周期和凋亡的影响;采用Real-time PCR检测部分周期相关基因的mRNA表达水平。结果显示,成功构建了小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Ghrelin,并能在3T3-L1细胞中得到很好地表达,其表达倍数是空质粒组的5倍(P0.01);转染后第48、72和96小时,Ghrelin转染组3T3-L1细胞的生长活力明显高于空载体组(P0.05或0.01);转染后第24小时,Ghrelin转染组S期细胞数量明显高于空载体组(P0.05);Ghrelin过表达对3T3-L1细胞的凋亡无明显影响(P0.05)。qRT-PCR结果显示,Ghrelin转染组细胞的c-myc(P0.05)、E2F1、CDK2(P0.05)等mRNA的表达量也明显高于空载体组,P53表达低于空载体组,差异显著(P0.05)。以上结果表明,Ghrelin过表达能显著促进3T3-L1细胞的增殖,但不影响凋亡。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除TLR3基因及其影响NDV复制的研究

TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检测细胞增殖速度;新城疫病毒La Sota毒株感染细胞,荧光定量PCR分析病毒增殖水平和TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFIT1的m RNA水平。结果,筛选出1株TLR3基因缺失7 bp的MDCK细胞。Western-blot结果显示,TLR3蛋白不表达,其增殖速度与野生型MDCK细胞无显著差异。新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-WT细胞后,TLR3的m RNA含量在四个时间点均显著上调(P0.01),表明新城疫病毒La Sota毒株可激活TLR3。再以新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-TLR3-/-细胞,IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第12小时和第24小时显著降低(P0.01),病毒拷贝数在感染后第6、12和24小时显著高于WT组(P0.01),表明TLR3在NDV介导的IFN-β反应和IFIT1的表达中具有重要作用,能够抑制NDV的复制。TLR7和MDA5的m RNA含量在感染后第6小时和第12小时显著上调(P0.01),IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第48小时表达显著上调(P0.01),NDV的拷贝数在第48小时在两组间显著性差异消失,提示TLR3缺失后TLR7和MDA5对其具有代偿作用。上述研究结果对NDV介导的天然免疫应答及疾病防控等研究具有重要意义。     

鹅γ-干扰素基因真核表达载体的构建及在幼仓鼠肾细胞中的表达

将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),得到真核表达质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ,经测序鉴定后,在室温条件下,质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ浓度20μg/mL,体积400μL,幼仓鼠肾细胞(BHK-21)细胞密度1×106/mL,电穿孔仪参数设为电压425 V、电容25μF、连续脉冲2次转染BHK-21细胞,待细胞贴壁后经过浓度为600μg/mL的G418连续筛选14 d后,出现抗性细胞克隆,将阳性BHK-21细胞上清液进行Western-blot鉴定,检测结果证明鹅IFN-γ在BHK-21细胞中得到表达。     

绵羊痘病毒E3L基因在Vero细胞中的表达

为了构建组成型表达绵羊痘病毒E3蛋白的真核表达载体,并检测E3蛋白在Vero细胞中瞬时表达的情况,将绵羊痘病毒E3L基因亚克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-E3L,经酶切和测序鉴定正确后转染至Vero细胞,利用Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)对E3蛋白的表达水平进行鉴定。结果显示,转染后第48小时可检测到E3L基因高水平的表达。这一研究结果为进一步研究绵羊痘病毒E3蛋白的生物学功能奠定了基础。     

扬子鳄α型干扰素基因的克隆分析及表达量的测定

为研究扬子鳄IFN-α基因的序列、结构及生物学功能,对其进行了基因克隆、序列分析及表达量的测定。根据GenBank中登录的扬子鳄IFN-α基因序列(XM_006026085.1)设计合成特异性引物,通过RTPCR从成年扬子鳄外周血中扩增及克隆IFN-α基因CDS区,对其进行测序分析、进化树构建、同源性分析及结构和功能预测,并对扬子鳄不同组织中IFN-α的表达水平进行测定和分析。结果显示,扬子鳄IFN-α基因的完整ORF序列为672 bp,编码氨基酸223个,其中前26个氨基酸为信号肽。成熟蛋白的分子质量为26ku,等电点为9.51。三级结构预测显示该蛋白含有5段α螺旋,符合I型干扰素结构特征。同源性和进化树分析结果显示,扬子鳄IFN-α基因与密西西比鳄的同源性最高,在进化树中处于同一分支。IFN-α表达量在血液中最高,肌肉组织中表达量最低,非冬眠期的表达量高于冬眠期的表达量。上述研究结果为进一步研究扬子鳄IFN-α基因表达调控机制和基因功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对猪肺泡巨噬细胞产生Ⅰ型干扰素mRNA转录水平的影响

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)对其产生Ⅰ型干扰素mRNA转录水平的影响,从猪繁殖与呼吸综合征阴性的健康仔猪肺中分离和培养PAMs,随机将其分为正常对照组、PRRSV感染组和poly(I:C)处理组。于感染后第12、24、36、48、60小时分别收集细胞,运用半定量RT-PCR法检测PAMs产生Ⅰ型干扰素的mRNA转录情况。结果显示,与正常对照组和poly(I:C)处理组相比,PRRSV感染组中IFN-α/βmRNA转录水平在各时间段均显著下调。其中,PRRSV感染组中IFN-αmRNA的转录在感染后第12~36小时呈先升高后降低的趋势,在第48小时有所上调,但在感染后第60小时IFN-αmRNA的转录显著下调;而IFN-βmRNA的转录在感染后第12~24小时基本没有变化,在第36小时最低,在感染后第48小时有所上调,但在感染后第60小时IFN-βmRNA的转录显著下调。结果表明,PRRSV可导致PAMs产生Ⅰ型干扰素的mRNA转录水平降低,从而使宿主细胞及机体非特异性免疫功能受到抑制。     

小反刍兽疫病毒F基因真核载体的构建与表达

根据GenBank中小反刍兽疫病毒(Nigeria 75/I株)F基因序列设计了引物,应用RT-PCR方法获得了目的基因,纯化回收后将其连接到克隆载体pMD18-T上.将鉴定与序列测定后的目的基因再克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,经过鉴定,成功构建了含有小反刍兽疫病毒F基因的真核细胞表达栽体pEGFP-N1-F.利用脂质体介导阳性pEGFP-N1-F质粒转染了BHK-21细胞.Western-blotting证实,表达的pEGFP-N1-F融合蛋白(90 ku)具有免疫活性.     

犬干扰素α4在CHO细胞中的稳定表达

为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP)。将该融合基因与真核表达载体pLeGFP连接,构建重组表达质粒pL-CaIFN-α4-GFP,并与其他3种慢病毒质粒(pC-Gp,pR-Rev和pC-VsvG)共同转染293FT细胞,包装获得重组慢病毒(vCaIFN-α4-GFP)。用获得的重组慢病毒感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经杀稻瘟菌素筛选、流式细胞仪分选和有限稀释法克隆转染细胞,获得表达CaIFN-α4-GFP的CHO细胞。用荧光显微镜观察构建的CHO细胞呈现绿色荧光,用MDCK与MDB K细胞检测CHO细胞培养上清液具有抗水疱性口炎病毒活性,活性分别为1.39×105和2.19×104U/m L。本研究成功地利用CHO细胞表达了具有活性的犬干扰素α4,为进一步研制高活性的犬IFN-α4生产系统奠定了试验基础。     

弓形虫GJS株致密颗粒6基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达

根据GenBank数据库中弓形虫RH株GRA6基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增GRA6基因,导入真核表达载体pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO,转化大肠杆菌DH5α,经酶切、PCR及测序鉴定,将重组质粒转染BHK-21细胞。GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,通过Western-blot分析,细胞裂解液中有一条约52 ku的条带,可被山羊抗弓形虫超免疫血清识别,大小与预测值相符。表明真核表达质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-GRA6中的GRA6基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性。     

禽呼肠孤病毒感染鸡胚成纤维细胞后三种细胞因子基因mRNA转录水平的动态变化

为了分析禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)对细胞产生的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影响,并探讨禽呼肠孤病毒的感染机制及病毒与宿主之间的作用关系,运用实时荧光定量RT-PCR技术,测定和分析了ARV-S1133感染CEF细胞后ARV结构蛋白σC和IL-1β、IL-6、TNF-α的动态转录水平。结果显示,ARV-S1133感染CEF后第10小时起病毒σC基因mRNA的相对表达量开始迅速上升,在第48小时达到最高峰(13 162.73倍);ARV-S1133感染后引起CEF中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达量发生变化,这3个基因mRNA的表达变化趋势相似。IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA转录水平在感染早期迅速上升,在感染后第6小时达到第1个峰值,随后下降,在感染中后期再次显著上升,在第48小时达到第2个峰值。IL-1β、IL-6、TNF-α在感染后第6、24、36和48小时的mRNA转录水平与对照组差异极显著(P0.01)。结果表明,ARV感染后可诱导CEF分泌IL-1β、IL-6、TNF-α的水平上调,进而发生炎症反应,说明IL-1β、IL-6、TNF-α可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。     

一种制备复制缺陷型重组水疱性口炎病毒新方法的建立

为了提高复制缺陷型重组水疱性口炎病毒(VSV△G*G)的制备效率,对传统制备方法进行了改良,在制备过程中先用VSV△G*G转导细胞1h后,再对其进行转染,24h后收集细胞上清并进行毒价测定。并与用传统方法制备的重组病毒的毒价进行比较,结果表明,用改良方法与传统方法制备的重组病毒具有相同的毒价,但改良方法比传统方法节省了20～48h,同时减少了表达的G蛋白诱导细胞融合所造成的细胞损伤。表明改良方法能够代替传统方法制备出高毒价的复制缺陷型重组病毒。     

鸭γ干扰素在体外细胞中抗鸭肠炎病毒作用的研究

为初步探究鸭γ干扰素(IFNγ)抗病毒作用,本研究从鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblast,DEF)中扩增出鸭γ干扰素(IFNγ) cDNA。将鸭IFNγ基因分别与真核表达载体PCAGG及原核表达载体p ET-32a连接,获得重组质粒PCAGG-IFNγ及pET-32a-IFNγ。转染PCAGG-IFNγ于DEF细胞后第24小时,接种鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)。同时将pET-32a-IFNγ在大肠杆菌原核表达系统中进行蛋白表达,并用纯化产物处理DEF细胞,处理后第24小时接种DEV,分别采用Western-blot、TCID50测定方法和荧光定量PCR检测重组蛋白IFNγ对DEV复制的影响,并检测细胞中相关干扰素刺激因子(interferonstimulated genes,ISGs)基因包括抗黏液病毒基因(Myxovirus resistance,Mx)、泛素样2′-5′寡聚腺苷酸合成酶基因(2′-5′oligoadenylatesynthetases-like,OASL)、DEAD框蛋白50基因(DEAD-box protein 50,DDX50)的表达情况。结果发现,无论是真核表达的还是原核表达的重组IFNγ均能抑制DEV的复制,并引起ISGs基因表达的上调。本研究结果为进一步探索鸭IFNγ的抗病毒机制提供了基础数据。     

伪狂犬病病毒Ea株UL14基因的真核表达和功能域分析

通过PCR方法扩增伪狂犬病病毒(PRV)Ea株UL14基因,克隆到pEGFP-C1载体中,构建EG-FP-UL14融合的真核表达质粒pEGFP-UL14。将pEGFP-UL14转染Hela细胞,并与对照质粒pEGFP-C1进行比较,发现EGFP-UL14融合蛋白在转染后第48小时荧光主要分布在胞浆,但随着时间的延长,荧光逐渐向细胞核中转移,在转染后第72小时完全定位于核中。为进一步分析UL14蛋白的细胞定位功能域,构建了一系列UL14C-端、N-端缺失突变体。将上述突变体分别与EGFP融合,构建了UL14不同区域与EG-FP融合的重组表达质粒,分别转染Hela细胞后,证实UL14的第37～65位氨基酸对其细胞定位具有重要作用。研究结果为进一步阐明PRV UL14的功能奠定了基础。     

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达

采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.将重组质粒转染BHK-21细胞.间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达.Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符.表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性.     

鸡IL-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性

从pMDChIL18克隆质粒扩增获得了ChIL18全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1( )。经酶切、质粒PCR鉴定和基因测序,鸡IL18全基因被正确重组到pcDNA3.1( )真核表达质粒上;将重组真核表达质粒pcDNA3.1( )ChIL18转染COS7细胞,转染细胞中含ChIL18基因的mRNA。SDSPAGE分析表明,表达产物是与ChIL18相符的约23ku的蛋白条带。鸡淋巴细胞转化试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。     

旋毛虫Ts43基因真核表达载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

利用RT-PCR技术从黑龙江省猪源旋毛虫获得了Ts43基因,并克隆入pcDNA3.1-CT-GFP真核表达载体中构建重组质粒,用该重组质粒在脂质体介导下转染Vero E6细胞,GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,通过Western-blot分析,细胞裂解液样品中有1条约66 ku的条带,可被小鼠旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,说明,真核表达载体pcDNA3.1-CT-GFP中的Ts43基因在VeroE6细胞中获得了表达,表达产物具有抗原性。     

A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒的构建及其免疫效力的研究

为构建A型塞内卡病毒(SVA)P12A-3C基因的真核表达质粒,提取SVACH-FJ-2017株的RNA,经RT-PCR方法扩增得到衣壳前体蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因,利用融合PCR方法获得P12A-3C基因并将其构建到真核表达质粒pc DNA~(TM)3.1/myc-His(-)上,获得表达质粒pCD-P12A-3C,用脂质体Lipofectamine~(TM)2000将该质粒转染293T细胞后,进行间接免疫荧光(IFA)检测;且用Myc单抗和SVA VP1单抗进行Western-blot分析;大量提取并纯化表达质粒,免疫小鼠后用间接ELISA法检测抗体水平变化情况。结果,SVA真核表达质粒pCD-P12A-3C经酶切及测序鉴定证明构建正确,转染293T细胞后IFA可见明显的绿色荧光,表明P12A-3C基因可在细胞内表达;将转染细胞裂解后进行Western-blot分析,结果显示该质粒可表达3C蛋白,且表达产物可与SVA VP1单抗发生特异性反应;免疫小鼠后抗体检测结果表明,二免后第14天,免疫小鼠抗体水平比对照组明显增高;该结果表明本研究构建的真核表达质粒pCD-P12A-3C可正确表达相应蛋白,且所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。结论:本研究成功构建了A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒并进行了免疫效力初步验证,为A型塞内卡核酸疫苗的研制奠定了基础。