弓形虫H4和Rab2基因真核表达载体的构建及其对N2a细胞凋亡和自噬的影响

本研究旨在探索弓形虫Rab2和H 4基因在神经细胞凋亡和自噬过程中的作用,并进一步研究雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对其的影响。本试验以弓形虫M e49虫株c DN A为模板,扩增H4和Rab2基因,并构建到真核表达载体pcDNA3.1 (+)上,转染小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a),同时设置RAPA给药组,检测目的基因及凋亡和自噬相关蛋白的表达情况。结果显示,重组质粒成功构建,弓形虫Rab2和H4基因在N2a细胞中表达,导致细胞凋亡相关蛋白Bcl-2下调和细胞自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ上调,但在RAPA组,Bcl-2却有上调趋势。此外还发现H4基因对于Rab2表达有促进作用。结果表明,H4和Rab2的表达可以促进N2a细胞的凋亡和自噬,而RAPA具有抑制细胞凋亡的作用,从而保护神经系统,这为弓形虫病的预防治疗提供了新思路。     

H3N2亚型猪流感病毒核蛋白基因的优化表达及抗原性分析

根据已获得的猪流感病毒(SIV)分离株A/Swine/Guangdong/9/05(H3N2)NP基因的核苷酸序列设计合成了1对带有特定酶切位点的引物,经RT-PCR扩增NP基因,将其克隆到pMD19-Simple-T载体,鉴定并测序正确后,构建pET32a-NP表达质粒,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为73ku,在25℃条件下主要以可溶性形式存在。将重组NP蛋白纯化后进行Western-blotting和间接免疫荧光试验,结果显示,表达蛋白可分别与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有良好的反应原性和交叉反应性;用纯化的重组NP蛋白免疫小鼠制备的多克隆血清也可与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV发生特异性反应,进一步证实所表达的重组NP蛋白具有良好的免疫原性。     

禽流感病毒M2e多拷贝重组蛋白的原核表达及其免疫原性分析

为了获得流感病毒M2e多拷贝重组蛋白并分析其免疫原性,通过比对GenBank中H5和H9亚型流感病毒的M2基因,选择其N端由23个氨基酸组成的胞外域(M2e)序列进行合成,并将4个M2e序列与3个位于HA246~260T/B细胞表位交叉串联,在其末端添加酵母转录因子,然后克隆到pGEX-6P-1载体中,表达重组蛋白。SDS-PAGE和蛋白免疫印迹试验分析表明,重组蛋白成功表达,而后纯化获得高纯度产物。经纯化的重组蛋白与弗氏佐剂混合后肌肉注射BALB/c小鼠,二免2周后采集小鼠血清并用ELISA检测M2e抗体水平;同时分离脾细胞并用ELISPOT检测特异性T细胞的数量。ELISA结果表明重组蛋白能诱导免疫组小鼠产生高水平的M2e特异性抗体;ELISPOT分析显示,在M2e肽段的刺激下,免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞中的斑点形成数达150个。结果表明,成功表达的重组蛋白具有良好免疫原性,为广谱型流感病毒亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

H3N2亚型犬流感病毒单链抗体的制备

为制备犬流感病毒(CIV)单链抗体(scFv),采用纯化的CIV抗原免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾组织提取总RNA,采用PCR方法扩增重链、轻链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR将重链、轻链通过弹性肽链连接物Linker连接,构建VH-Linker-VL融合片段,并将其插入原核表达载体pET-32a(+)后转化大肠杆菌,重组菌经IPTG诱导表达,获得45 ku左右的目的蛋白。Western-blotting结果表明,该蛋白能被抗His标签的单抗特异性识别。间接ELISA及中和试验结果表明,scFv能够与CIV发生特异性结合反应,具有中和活性。本研究成功制备了针对H3N2亚型CIV单链抗体,为该病毒感染的诊断和治疗提供了物质基础。     

复方苦芩对小鼠免疫功能及犬IL-4 mRNA和IFN-γ mRNA表达的影响

为了探讨复方苦芩对免疫低下小鼠免疫功能和对犬细胞因子IL-4mRNA、IFN-γmRNA表达的影响,将120只小鼠随机分为空白对照组、模型组(环磷酰胺造免疫低下小鼠模型,不给药)、阳性药物对照组(黄芪多糖注射液)、复方苦芩制剂高、中、低剂量组,连续给药7d,给药后,除空白对照组外,各组腹腔注射环磷酰胺0.2mL(80mg/kg)制造免疫低下模型,1次/d,共3d。于末次给药后第1小时,测定碳粒廓清指数、脾指数、胸腺脏器指数及T、B淋巴细胞转化率;建立犬细小病毒模型,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法观察复方苦芩对犬细胞因子IL-4mRNA、IFN-γmRNA表达的影响。结果显示,复方苦芩能增加小鼠脾指数和胸腺指数,明显增加T、B淋巴细胞的转化率和碳清值,降低犬细小病毒引起的犬血清细胞因子IL-4含量及其mRNA表达的增加,升高犬细小病毒引起的犬血清IFN-γ含量及其mRNA表达的降低。结果表明,复方苦芩具有增强小鼠非特异性免疫功能,降低犬血清细胞因子IL-4含量及其mRNA的表达,升高犬血清IFN-γ含量及其mRNA的表达的作用。     

抗弓形虫SAG2蛋白单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

为制备抗弓形虫SAG2蛋白的单克隆抗体(McAb),用纯化的rSAG2蛋白免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选稳定分泌高效价McAb的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单抗。用ELISA方法测定其效价;单克隆抗体类型鉴定试纸条鉴定其类型;Western-blot和IFA试验进行特异性鉴定。结果显示,筛选出2株能稳定分泌抗SAG2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为5E2、2A8。间接ELISA测定其效价分别为1∶256 000、1∶128 000;2株单克隆抗体亚型均为IgG1型,轻链均为κ链;Western-blot与IFA试验表明,这2株McAb均能够特异性识别天然构象的SAG2蛋白,并且进一步说明此蛋白是位于弓形虫膜表面的蛋白。成功获得了具有较高特异性及敏感性的抗SAG2蛋白的单克隆抗体,并能特异性识别天然构象的SAG2蛋白,为弓形虫病免疫诊断及基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠免疫保护效果的评估

为评估旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对BALB/c小鼠的免疫保护作用,选用2种重组表达的Serpin型和Kazal型旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（TsAdSPI和TsKaSPI）,联合弗氏佐剂通过腹腔注射的方式单独免疫小鼠,用间接ELISA法检测免疫后小鼠特异性血清抗体Ig G以及Ig G亚型（IgG1和Ig G2a）的水平,用CCK-8法测定重组蛋白刺激后脾淋巴细胞的增殖情况,用ELISA法检测脾淋巴细胞培养液上清中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-12和IL-4的水平;使用旋毛虫肌幼虫攻击感染免疫后的小鼠,计算并分析小鼠肠道成虫减虫率及肠道病理变化,并评估TsAdSPI和TsKaSPI与ISA206佐剂联合免疫小鼠后对小鼠肠道成虫减虫率的影响。结果表明,与PBS组相比,2种重组蛋白所诱导的Ig G和Ig G亚型抗体水平均明显升高,IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10表达水平也均显著升高,且重组蛋白可诱导免疫小鼠脾淋巴细胞的体外增殖;攻虫结果表明,2种重组蛋白免疫后小鼠肠道旋毛虫成虫数量较PBS组显著减少且肠道病理变化减轻;2种重组蛋白联合免疫组的成虫减虫率高于单独免疫组。上述结果...     

展呈H5N1亚型禽流感病毒M2e表位鞭毛蛋白的构建及其免疫原性

以重组质粒pET-fliC和pUC57-M2e2为模板,通过重叠PCR将M2e2基因插入fliC的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/M2e2。将fliC/M2e2片段插入原核表达载体pET30a+,获得重组质粒pET-fliC/M2e2,将其转化鼠伤寒沙门氏菌LB5000,获得重组菌LB5000(fliC/M2e2)。应用P22噬菌体转导技术,将fliC/M2e2基因导入都柏林沙门氏菌SL5928的基因组中,经生化血清学鉴定、动力学测定、透射电镜观察、Western-blot分析,将阳性转导菌命名为SL5928(fliC/M2e2)。提取重组菌鞭毛蛋白fliC/M2e2作用HEK293-mTLR5细胞,能刺激细胞分泌IL-8。将fliC/M2e2通过皮下注射途径免疫C3H/HeJ小鼠,50μg/只。结果显示,二免后第14天,fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫组的血清抗体效价与对照组之间呈现显著性差异(P<0.05)。ELISPOT结果表明,在脾细胞中,fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫组检测到较高水平的IFN-γ和IL-4分泌细胞,且免疫应答以Th1型为主。结果表明,构建的fliC/M2e2嵌合基因能够在沙门氏菌中表达,重组嵌合鞭毛蛋白fliC/M2e2能激发机体针对M2e表位的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答。     

猪囊虫TS21抗原DNA接种小鼠的免疫应答

将 4 0只BALB/c小鼠随机分为 2组 ,A组以VR10 2 0免疫作为对照 ,B组以TS2 1抗原基因的真核表达型质粒VTS2 1免疫。用ELISA检测免疫小鼠IgG总量和特异性抗体水平 ,MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞伴刀豆蛋白A(ConA)刺激的增殖反应及IL 2的诱生活性 ,常规法检测外周血免疫细胞数量的动态变化。结果显示 ,VTS2 1免疫小鼠血清的IgG含量和特异性抗体效价显著高于对照组小鼠 ;免疫小鼠脾淋巴细胞ConA刺激增殖反应和IL 2诱生活性均比对照组小鼠显著增强 ;免疫小鼠的淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞的数量也显著超过对照组。免疫小鼠的细胞和体液免疫反应显著增强 ,表明VTS2 1具有很强的免疫激活作用 ,有进一步研制开发成为猪囊虫病DNA疫苗的潜力     

H4和H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单因子血清的制备

为制备H4和H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单因子血清,以便快速鉴定H4以及H6亚型禽流感病毒,根据GenBank中A/Duck/Hunan/S11090/2012(H4N6)和A/Chicken/Guangdong/S1312/2010(H6N2)的血凝素基因序列,人工合成并进行密码子优化后插入真核表达载体pCAGGs,通过双酶切鉴定以及测序确定重组质粒构建成功。给每只SPF鸡注射免疫200μg重组质粒,免疫周期为30d,第3次免疫后第10天,通过心脏采血收获单因子血清。间接免疫荧光试验和Western-blot试验的结果表明,重组质粒中HA基因均被成功表达。利用H4和H6亚型禽流感病毒抗原进行血凝抑制试验,结果显示抗体效价均在64至128之间,表明制备的单因子血清抗体效价较高,敏感性强。使用其他亚型的禽流感病毒以及新城疫病毒为抗原进行血凝抑制试验发现结果均为阴性,表明制备的单因子血清与其他亚型禽流感病毒及新城疫病毒无交叉反应。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒(pCI-GP5和pcDNA-U-GP5)分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力,LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性,并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现,2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周,pCI-GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA-U-GP5质粒免疫组;而pcDNA-U-GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4-CD8 T细胞比例明显高于pCI-GP5组。表明,GP5基因可诱导产生较高的免疫反应,泛素与GP5的融合表达可增强PRRSV GP5诱导的细胞免疫反应。     

抗弓形虫独特型抗体的研究——抗独特型抗体的制备及其免疫原性测试

用抗弓形虫单克隆杂交瘤细胞株(3C_2)扩大培养,于腹腔注射BALB/C小鼠诱生腹水,经3次饱和硫酸铵盐析,透析,DEAE-Sephadex-A_(50)离子交换层析,除菌,制得纯化McAb(Ab_1),蛋白含量2mg/ml,用福氏佐剂乳化后免疫健康家兔4次,放血分离血清,再经盐析和层析处理,制得多克隆抗弓形虫独特型抗体(Ab_2),用佐剂制备疫苗,3次免疫绵羊(5～10mg/只)2只。共采集4次血清,制得抗抗弓形虫独特型抗体(Ab_3),用IHA法检测抗体效价为1:64～1024。证实抗独特型抗体(Ab_2)是特异的,是能模拟弓形虫抗原,具有类似弓形虫免疫原性,并可激发宿主免疫应答产生抗体,进而证实独特型和抗独特型的免疫网络学说在弓形虫病免疫中的应用价值。     

弓形虫烯醇化酶2基因的原核表达与鉴定

为深入研究弓形虫烯醇化酶的生物学功能,根据已发表的eno2基因序列设计引物,通过RTPCR方法扩增弓形虫RH株的eno2基因。将eno2克隆到载体pET-28a(+)中后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达并优化表达条件,SDS-PAGE分析表达情况,并通过Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定其免疫活性。结果显示,eno2基因全长1 353bp,编码444个氨基酸,与GenBank中登录的弓形虫烯醇化酶基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性均高达99.8%,与其他物种的烯醇化酶的同源性较低。在pH7.5、28℃和IPTG终浓度0.1mmol/L条件下,重组蛋白ENO2得到高效可溶性表达,分子质量约为55ku。Western-blot结果显示,重组蛋白能被感染弓形虫的犬阳性血清识别,说明ENO2具有较好的反应原性,可以作为血清学诊断抗原。IFA表明,NO2在弓形虫的细胞质和细胞核中均有分布。结果表明,本研究成功获得了可溶性、具有良好免疫活性的弓形虫重组蛋白ENO2,为深入研究其生物学功能奠定了基础。     

分泌抗弓形虫GJS株、NT株和RH株McAb杂交瘤细胞株的建立

自Khlor和Milstein 1975年创立淋巴细胞杂交瘤技术后,使在体外产生抗弓形虫特异性McAc及在此基础上分离、提取抗弓形虫保护性抗原和研制弓形虫基因工程苗成为可能,据此我们将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞分别与刚地弓形虫GJS珠、NT株和RH株可溶性抗原免疫BALB/C小鼠的脾细胞融合,经IHA检测和克隆化后,获得了4株杂交瘤细胞。该4株杂交瘤细胞所分泌的McAb经鉴定均属IeG_1亚类,4株杂交瘤细胞经连续60代传递和5～23个月冻存复苏     

分泌抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立——体外免疫法制备免疫脾细胞

作者用纯化弓形虫速殖子可溶性抗原体外免疫BALB/C小鼠的正常脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ABC—ELISA和IHA筛选和3次克隆化培养后获得了1株分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞(E5)。E5杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经琼脂双扩散免疫试验确定为IgGl亚类抗体。单克隆抗体的抗原吸收试验结果证明E5单克隆抗体为抗弓形虫特异性抗体。E5杂交瘤细胞的染色体数目为92～108,经连续30代传递培养和4个月冻存复苏试验证明其分泌特异性单克隆抗体的性能相当稳定。初步证实E5单克隆抗体针对一种弓形虫的共同抗原成份。     

TSOL18抗原重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗对小鼠的免疫保护作用

用构建好的活栽体疫苗X4550(pYA3341-TSOL18)免疫小鼠,检测小鼠血清中IgG、IgM和肠液中IgA抗体的产生及各免疫组织重组疫苗株的分布情况,分析小鼠脾细胞亚型的分化,探讨了重组疫苗的免疫保护效果.结果显示,在免疫后第7 d,小鼠血清中有抗TSOL18 IgM产生,在二免后第28 d,gG的D492nm值达到0.645,在二免后第42 d,肠液中有抗TSOL18分泌性IgA抗体产生,表明重组疫苗能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种方式的免疫应答;小鼠免疫后第21 d在脾中仍能检测到大量的重组疫苗株,表明TSOL18重组蛋白的表达没有影响重组疫苗X4550(pYA3341-TSOL18)的定居能力;免疫小鼠的CD4 、CD8 T淋巴细胞数目明显增多,D4 /CD8 T细胞比值也显著增高(P＜0.01),提示重组疫苗可能通过提高CD4 /CD8 T细胞比值来发挥免疫作用.     

羊IL-2和OrfV-F1L基因疫苗联合免疫小鼠的免疫应答研究

为评价pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答,分别将p VAX1-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照组通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ和TNF-α)、Th2型(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价及IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子水平均显著高于pVAX1-F1L组,与p VAX1组、PBS组相比差异极显著(P0.01);pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6和IL-10细胞因子水平均显著高于pVAX1组和PBS组,与pVAX1-F1L组相比差异不显著(P0.05);且pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-F1L组、pVAX1组和PBS组(P0.01)。结果表明,p VAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠,能诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫,p VAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能促进Th1型细胞因子的分泌。     

牛分枝杆菌esat-6和mpb70-mpb83基因DNA疫苗的免疫效果

用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因,连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠:pCE6组、pC70-83-E6组、pcDNA3.1(+)和PBS对照组,采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况。结果表明,2重组质粒免疫组小鼠的血清抗体水平持续上升,而2对照组始终维持在较低水平,且pC70-83-E6组小鼠的抗体水平高于pCE6组。经PPD刺激后,pCE6组和pC70-83-E6组小鼠的SI值与2对照组均差异显著(P<0.05),2重组质粒免疫组间差异不显著(P>0.05);2重组质粒免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ均显著高于2对照组(P<0.05),且pC70-83-E6组明显高于其他3组(P<0.05)。证实本试验构建的2种牛分枝杆菌DNA疫苗可有效诱导实验动物产生体液免疫和细胞免疫应答。     

PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原优势区基因真核表达质粒的构建及其免疫效果

采用PCR法扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2抗原优势区(ORF2′)基因和猪细小病毒(PPV)VP2基因,将目的基因定向插入真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2′-VP2。将重组质粒免疫小鼠,同时设立PCV亚单位疫苗、PPV灭活疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,PCV2和PPVIgG抗体效价进行了检测。结果表明,从免疫后第7d起,pCI-ORF2′-VP2免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和抗PCV2、PPV的特异性抗体效价都显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于空载体对照组,且重组质粒组在第21～42d诱导的免疫水平显著或极显著强于PPV灭活疫苗组。证实,构建的重组质粒pCI-ORF2′-VP2能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

扬子鳄α型干扰素蛋白的原核表达和纯化及其多克隆抗体的制备

为了进一步研究扬子鳄IFN-α,构建原核表达载体pET32a-IFN,导入大肠杆菌表达系统后诱导表达,并纯化靶蛋白.使用纯化重组蛋白作为抗原,加入佐剂乳化后免疫3只雌性的6周龄BALB/c小鼠,免疫后第35天对小鼠采血分离血清并测定效价.结果显示,成功构建原核表达载体pET32a-IFN,Western-blot鉴定显...