egr-miR-71过表达对绵羊PBMCs蛋白组的差异表达分析

为了探究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)来源的miR-71(egr-miR-71)对绵羊外周血单核细胞(PBMCs)蛋白组的影响。本研究使用密度梯度离心法分离得到绵羊PBMCs,并使用电穿孔法将egr-miR-71转染至绵羊PBMCs,用qPCR检测转染效率。基于iTRAQ方法,对比分析egr-miR-71过表达对绵羊PBMCs蛋白表达的影响,通过qPCR和Western-blotting对骨髓源性生长因子(MYDGF)转录水平和翻译水平进行验证。结果显示,绵羊PBMCs转染egr-miR-71模拟物后,miR-71的相对表达量极显著上调(P<0.01)。利用iTRAQ共鉴定出7642个蛋白质,其中157个呈差异表达,与对照组相比,68个蛋白显著上调,89个蛋白显著下调。下调的蛋白主要包括巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MYDGF、酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)和碳酸酐酶(CAs)等。这些差异蛋白主要参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、转化生长因子-β(TGF-β)等信号通路。qPCR和Western-blotting结果显示,与对照组相比,模拟物转染组中MYDGF转录和翻译水平均显著下调(P<0.05)。通过对转染egr-miR-71后绵羊PBMCs的蛋白进行组学分析,初步了解了egr-miR-71对绵羊PMBCs表达蛋白的调控,鉴定出的差异蛋白可能在细粒棘球蚴与宿主互作中发挥重要作用。这为深入研究细粒棘球绦虫的感染机制提供了思路,也为新型抗包虫病药物的研发提供了理论依据。     

毛发弯曲度相关蛋白KRT71和β-catenin在绵羊毛囊的定位表达

绵羊不同部位皮肤毛发的长度、密度、弯曲度等存在差异,背部毛发弯曲细长,而耳部、腹股沟部毛发粗直。为从蛋白水平探究Keratin71(KRT71)和β-catenin对绵羊毛纤维弯曲形成的影响,运用免疫组织化学技术对KRT71和β-catenin在绵羊背部、腹股沟部和耳部皮肤毛囊中进行研究。结果显示,KRT71在毛囊内根鞘特异表达,表达量为背部耳部腹股沟部,且腹股沟部表达量与背部和耳部差异显著;β-catenin在各部皮肤表达量为背部腹股沟部耳部,且耳部的表达量与腹股沟部和背部差异显著。研究结果提示,KRT71、β-catenin的表达量与毛发弯曲成正相关,可能在绵羊毛弯曲形成中发挥促进作用。     

旋毛虫IFN-γ诱导的溶酶体硫醇还原酶对大鼠外周血单个核细胞功能的影响

为了研究旋毛虫(Trichinella spiralis)IFN-γ诱导的溶酶体硫醇还原酶(GILT)对体外大鼠外周血单个核细胞(PBMCs)免疫功能的影响,将不同质量浓度的重组蛋白TsGILT(rTsGILT)与大鼠PBMCs体外共孵育后,用间接免疫荧光技术检测该蛋白与细胞之间的结合情况,并测定其对细胞增殖、迁移、凋亡、吞噬和NO分泌的影响。结果表明:rTsGILT可与大鼠PBMCs结合,可显著促进大鼠PBMCs的增殖、迁移、吞噬和NO的分泌(P<0.01),并呈现一定剂量依赖性;10、20μg/m L的rTsGILT对大鼠PBMCs的凋亡没有影响,40和80μg/m L的rTsGILT均能显著促进大鼠PBMCs的凋亡(P<0.001)。综上所述,旋毛虫GILT能通过多种途径影响宿主PBMCs发挥免疫作用,对宿主的免疫应答具有一定的促进作用。     

绵羊和山羊嗜血支原体感染的检测及分子鉴定

为了解绵羊和山羊嗜血支原体在甘肃、辽宁、内蒙古、宁夏、重庆、海南等地的流行状况及病原种类,利用瑞氏染色方法和已发表的嗜血支原体通用qPCR方法,对2011—2015年间采自上述地区的绵羊和山羊血液样品346份进行了检测,并对部分qPCR阳性样品扩增产物进行了测序和序列分析。结果,在甘肃、内蒙古的绵羊样品中和重庆、海南的山羊样品中检出嗜血支原体;其中,瑞氏染色方法的绵羊样品阳性率为12.45%(33/265),山羊样品阳性率为24.69%(20/81);qPCR绵羊阳性率为22.26%(59/265),山羊阳性率为37.04%(30/81)。对部分阳性样品的qPCR产物进行的序列分析结果显示,绵羊样品中5/7份为绵羊支原体和绵羊嗜血支原体待定种共同感染,1/7为绵羊支原体感染,1/7为绵羊嗜血支原体待定种感染;山羊样品中,2/3为绵羊支原体感染,1/3为绵羊嗜血支原体待定种感染。本文在我国首次证实山羊和绵羊中流行绵羊支原体和绵羊嗜血支原体待定种两种不同的嗜血支原体,且绵羊中存在两种嗜血支原体共同感染的情况。     

山羊边虫病的研究——病原鉴定和临床症状观察

内蒙古自治区额济纳旗自1972年以来,在山羊群中流行一种季节性的传播性疾病,临床上以贫血,黄染和消瘦为主要特征,直接影响着养羊业的发展。1985年兰州兽医研究所对额济纳旗兽医站送检的病羊的血片做了检查,在红细胞中发现大量的虫体,经鉴定为绵羊边虫(Anaplasma ovis Lestoguard,1924),从而确诊额济纳旗山羊群中流行的疾病为绵羊边虫病。我们利用所分离的虫株人工感染山羊获得成功。健康山羊红细胞染虫率不超过4％,除脾山羊可达71％。并对病原形态、临床症状及病理剖检做了详细观察。     

VEGF在绵羊性成熟前后睾丸组织中表达水平的比较分析

为探索血管内皮生长因子(VEGF)在绵羊睾丸发育和精子发生过程中的作用,本研究以绵羊性成熟前后睾丸组织为研究对象,采用RT-PCR和Western-blot方法检测VEGF m RNA及其蛋白在绵羊性成熟前后睾丸组织中的表达差异,利用SSPS 18.0对数据进行比较分析。结果显示,VEGF m RNA及其蛋白在绵羊性成熟前后睾丸组织中均有表达,二者在性成熟后睾丸中的表达量明显高于性成熟前睾丸(P0.05),且VEGF m RNA与蛋白的表达趋势趋于一致。由此可见,VEGF在绵羊睾丸发育和精子发生过程中具有促进作用,这为进一步探索VEGF在睾丸中的作用机制奠定了一定的理论基础。     

enJSRV囊膜蛋白激活绵羊绒毛膜滋养层细胞中MAPK信号通路的研究

为初步探究内源性绵羊肺腺瘤病毒(en JSRV)囊膜蛋白(Env)在绵羊绒毛膜滋养层细胞中的作用机制,利用免疫组织化学染色法检测enJSRV-Env在绵羊胎盘中的主要表达区域,继而瞬时转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRV-env到绵羊绒毛膜滋养层细胞,并加入Erk抑制因子PD 98059、p38抑制因子SB 203580及JN K抑制因子SP600125,同时转染重组质粒至293T细胞中作为对比。利用W estern-blot分别检测2种细胞中Erk1/2、p38和JNK蛋白激酶磷酸化水平的变化。免疫组织化学染色结果显示,enJSRV-Env主要表达于绵羊胎盘中绒毛膜滋养层细胞。Western-blot结果显示,绵羊绒毛膜滋养层细胞中,转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRV-env组中p-Erk1/2、p-p38和p-JNK的表达量均显著高于对照组和加入抑制因子组(P0.05);加入3种抑制因子后,3种蛋白激酶的磷酸化水平较转染组显著降低。293T细胞中,转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRVenv组中p-p38的表达量显著高于对照组(P0.05),p-JNK的表达量极显著高于对照组(P0.01)。因此,enJSRV-Env激活了绵羊绒毛膜滋养层细胞中MAPK信号转导通路。再通过与293T细胞的结果对比可知,enJSRV-Env在这2种细胞中的作用机制有所不同。本研究为今后继续深入探究en JSRV-Env的作用机制提供了新的思路和依据。     

间隙连接蛋白Cx43和Cx45在体外受精绵羊早期胚胎中的表达

为了研究间隙连接蛋白Cx43和Cx45在体外受精绵羊胚胎早期发育过程各阶段的表达情况,利用RT-PCR扩增得到绵羊Cx43(43 ku)及Cx45(45 ku)基因的mRNA,并进行序列测定。收集绵羊未成熟和成熟卵母细胞以及体外受精早期胚胎各发育阶段的卵裂球细胞,通过RT-PCR半定量检测Cx43和Cx45基因的mRNA表达量;通过免疫组织化学方法结合激光扫描共聚焦显微镜检测Cx43和Cx45蛋白在绵羊体外受精的早期胚胎发育过程中的表达情况及表达区域。结果表明,在绵羊卵母细胞成熟过程以及早期胚胎发育的各个时期,Cx43及Cx45在mRNA水平和蛋白水平均有表达;Cx43、Cx45蛋白主要分布在细胞膜表面,在细胞质和细胞核中表达微弱。研究结果为进一步探索Cx43和Cx45在绵羊早期胚胎发育过程中的作用提供了试验数据。     

日本血吸虫冷冻童虫苗免疫绵羊试验

Taylor等(1976)的研究证明,用同种血吸虫辐照尾蚴或辐照童虫免疫接种绵羊,可使其对梅氏血吸虫(S.mat-theei)产生抵抗力。该作者等1979年用同种辐照童虫苗免疫接种绵羊,证明后者对牛血吸虫(S.bovis)也能产生抵抗力。Bick-le等(1979)应用同种和异种辐照致弱童虫免疫绵羊对抗梅氏血吸虫和牛血吸虫进一步作了试验观察。但直到1985年James等才首先应用冷冻辐照致弱童虫苗免疫接种绵羊预防牛血吸虫。关于绵羊日本血吸虫病方面,尚未见到有关免疫预防的报道。绵羊是日本血吸虫的易感动物之一。在我国人畜共患血吸虫病的传播方面,绵羊具有一定的重要性。为了应用日本血吸虫冷冻童虫苗进行家畜血吸     

藏系绵羊肺腺瘤病的病理形态学观察

绵羊肺腺瘤病(Sheep pulmonary adenomatosis,SPA)目前认为是由慢病毒所引起的一种接触性传染性肺脏肿瘤病,亦称绵羊肺癌(Sheep pulmonary carcinoma,SPC)。 为了调查甘南藏系绵羊是否存在此病,我们于1985年10月在甘南肉联厂教学实习期间,对3例疑似SPA的绵羊肺脏进行了病理形态学观察诊断。 (一)材料和方法 对检出的3例病肺,分别从心叶、尖叶、膈叶及副叶的后缘和下缘、肺门淋巴结和纵膈淋巴结各取组织一块。固定于10％福尔马林液中。石蜡切片、H—E染色,镜下观察。 (二)结果     

抗布鲁氏菌单克隆抗体的研制及cELISA方法的建立

利用杂交瘤技术筛选出3株抗布鲁氏菌的特异性单克隆抗体5C10、4D2和3E4;利用单抗5C10建立了检测血清中布鲁氏菌抗体的竞争ELISA(cELISA)方法。用该方法对320份牛血清样品和147份绵羊血清样品进行了检测,并与商品化布鲁氏菌病试剂盒进行了比较。结果显示,用建立的cELISA方法和商品化布鲁氏菌病试剂盒对320份牛血清样品和147份绵羊血清样品的检测符合率分别为95.6%和92.5%。用补体结合试验(CFT)进一步检测差异结果的样品(25份),证明建立的cELISA与CFT的吻合率更高(21/25),而商品化布鲁氏菌病试剂盒与CFT的吻合率较低(4/25)。结果表明,本研究建立的用于检测布鲁氏菌抗体的cELISA方法更特异敏感,在布鲁氏菌病根除计划中将具有重要的应用价值。     

类山羊传染性胸膜肺炎诊断和防治的研究——病原诊断

于1987年从甘肃省陇东类山羊传染性胸膜肺炎流行区采取临床可疑的山羊、绵羊病料,进行了一系列病原诊断研究,结果:排除了相关致病因素,如梅迪,维士那,山羊关节炎脑炎(CAE),衣原体及相关致病菌感染和寄生虫侵袭;最终从21例山羊6/6例绵羊病变肺组织中培养分离出支原体13株/4株,分菌率均在60％以上,分离株经初步鉴定后,经英国国际支原体鉴定中心(NCTC)最终鉴定均为绵羊肺炎支原体(M.ovipneumonia);以分离株人工感染健康山羊7只,绵羊3只,结果6/7的山羊,2/3的绵羊于接种后第14天始形成与自然病例相似的病变,并以7/7山羊,2/3绵羊病变肺组织中收回原接种物;以琼脂双扩散,试管凝集反应及间接血球凝集试验进行抗原性研究结果证明,分离株与绵羊肺炎支原体标准株(y—98)具有共同抗原性。从而不仅首次确证了该地本病是由绵羊肺炎支原体所致,且对山羊和绵羊都具有很高的感染率和较强的致病性。     

绵羊痘病毒E3L基因在Vero细胞中的表达

为了构建组成型表达绵羊痘病毒E3蛋白的真核表达载体,并检测E3蛋白在Vero细胞中瞬时表达的情况,将绵羊痘病毒E3L基因亚克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-E3L,经酶切和测序鉴定正确后转染至Vero细胞,利用Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)对E3蛋白的表达水平进行鉴定。结果显示,转染后第48小时可检测到E3L基因高水平的表达。这一研究结果为进一步研究绵羊痘病毒E3蛋白的生物学功能奠定了基础。     

宁夏羊胃肠道线虫对现行驱虫药的抗药性调查

采用粪便虫卵减少试验对宁夏地区所属灵武、贺兰、盐池、吴忠、中宁、中卫、永宁和银川市郊8个县(市)的12个绵羊场、6个山羊场进行了丙硫苯咪唑和阿维菌素抗药性的随机调查。结果表明:在用丙硫苯咪唑调查的10个绵羊场和6个山羊场中,虫卵减少率在95%以下和95%的置信域下限在90%以下的有山羊场2个、绵羊场2个,证明对丙硫苯咪唑有抗药性;1个绵羊场和1个山羊场的虫卵减少率是96.3%、95.9%,但95%置信域的下限在90%以下,具有抗药性可疑;山羊群中丙硫苯咪唑的抗药性为33.3%,绵羊群为20.0%。用同样的方法调查了1个山羊场和5个绵羊场(其中有4个羊场曾执行了丙硫苯咪唑的试验),查出1个山羊场和1个绵羊场对阿维菌素具有抗药性可疑,其虫卵减少率分别为97.3%和95.5%,置信域下限在90%以下。揭示了宁夏地区羊消化道线虫对现行驱虫药的抗药状态,为今后防治提供了依据。     

绵羊生殖道中ghrelin基因的克隆及其表达

从雌性绵羊输卵管、子宫体、子宫颈、阴道组织中提取总RNA,根据已获得的绵羊ghrelin基因eDNA序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出了绵羊ghrelin基因;将扩增产物克隆于pMDl9-T载体后进行测序.以a-肌动蛋白(a-actin)基因作为内参,采用半定量RT-PCR法扩增ghrelin基因,经琼脂糖凝胶电泳后,应用凝胶成像分析系统计算雌性绵羊不同生殖道组织中ghrelin基因的表达量.结果显示,从雌性绵羊生殖道各组织均扩增出了233 bp的ghrelin基因片段;ghrelin基因在子宫体的表达量最高,输卵管内次之,子宫颈和阴道内最低.表明,ghrelin对雌性绵羊生殖系统的调节及生殖激素的分泌等具有重要作用.     

免疫途径对绵羊支原体肺炎灭活疫苗安全性和抗体水平的影响

为了评价免疫途径对绵羊支原体肺炎灭活疫苗安全性和免疫效果的影响,将该疫苗分别于颈部皮下和肌肉各接种205只绵羊,对全身性反应和注射局部进行安全性观察,并于免疫当天和免疫后第21天各采集50只绵羊血分离血清,用绵羊肺炎支原体ELISA试剂盒检测血清抗体阳转率和抗体水平。结果,皮下注射组(19.5%)与肌肉注射组(17.6%)全身性不良反应均较高,差异不显著;但皮下注射组(36.6%)的局部不良反应显著高于肌肉注射组(2.4%);肌肉注射组抗体阳转率(89.8%)和平均D450值升高水平(免疫后比免疫前升高0.89)均显著高于皮下注射组(77.1%,0.45)。上述结果表明,肌肉注射绵羊支原体肺炎灭活疫苗的安全性和免疫效果优于皮下注射。     

多房棘球蚴成体未分化细胞的鉴定及其分布特征

利用有丝分裂分子标志———组蛋白H3(Ser10)标记多房棘球蚴成体未分化细胞(neoblast)。同时,利用成体未分化细胞可能的分子标志———miR-71和AGO-2,通过原位杂交方法分析其表达特征。结果显示,多房棘球蚴组蛋白H3阳性细胞没有明显的组织分布特征,而且数量少;AGO-2阳性细胞在组织分布和数量上与组蛋白H3阳性细胞相似,而miR-71阳性细胞在原头蚴中分布广泛,并且在不同发育阶段的原头蚴中miR-71的表达水平存在明显差异。这些研究结果表明,miR-71分子在多房棘球蚴成体未分化细胞中呈非特异表达,不能作为鉴定它的分子标志。     

聚合酶链反应检测绵羊肺炎霉形体的研究

参照基因库中已发表的绵羊肺炎霉形体Y98株的 1 6SrDNA序列 ,设计合成了 1对引物 ,建立了聚合酶链反应 (PCR)检测绵羊肺炎霉形体的方法。结果显示 ,所建立的PCR能特异扩增绵羊肺炎霉形体的DNA ,而对照的菌株均为阴性 ;其敏感性可达 1pg。经对绵羊肺炎霉形体分离株HD 1的扩增产物进行测序 ,并与绵羊肺炎霉形体标准株Y98的 1 6SrDNA序列进行比较 ,发现有 6个碱基的差异     

绵羊肺炎支原体免疫蛋白质组学的初步研究

利用双向电泳及免疫印迹方法对绵羊肺炎支原体MoGH3-3分离株的抗原蛋白进行筛选,并采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱对其进行初步鉴定。结果,共筛选到MoGH3-3株3个主要抗原蛋白点,其中2个被鉴定为延伸因子(elongation factor Tu,EF-Tu),1个为丙酮酸脱氢酶E1-a亚单位(pyruvate dehydrogenase E1-alpha subunit,PDHA)。结果表明,EF-Tu及PDHA是绵羊肺炎支原体主要的抗原蛋白,这为下一步绵羊支原体肺炎基因工程疫苗的研制提供了靶标。     

青海绵羊肺腺瘤病的病理形态学研究

世界许多国家均存在绵羊肺腺瘤病。我国的甘肃、新疆、内蒙古等省(区)亦有本病发生的报道。1980年9～11月我们在青海省海南肉联厂屠宰绵羊的宰后检验中,对疑似肺腺瘤病的74例进行了肉眼和病理组织学的观察,结果证实为绵羊肺腺瘤病。现报告如下。