单克隆抗体技术诊断地方性牛白血病的研究

目前,用于牛白血病诊断的方法很多,但尤以血清学试验检测特异性抗体是诊断BLV感染最实用、经济、快捷和高度敏感的方法,如免疫扩散试验(ID)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫试验(RIA)等方法已被广泛应用。但研究结果表明,并非所有BLV感染的抗体阳性牛均发展成为肿瘤,其发病率低于感染牛中的5％(Burng等1980),因此在BLV感染率低的地区,可以将抗体阳性牛屠杀,以达到净化牛群的目的,而在BLV感染率高的地区这样做造成重大经济损失。目前,国外已使用单克隆抗体技术诊断地方性牛白血病。     

近年来衣原体研究的进展

随着分子生物学技术的迅速发展,研究者们开始从亚细胞及分子水平来研究衣原体,从而大大提高了人们对衣原体的认识。本文就近年来在衣原体研究中的进展情况作一简要介绍。 (一)单克隆抗体在衣原体抗原结构研究和诊断中的应用 1982年Stephens等建立了能分泌沙眼衣原体单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,并结合微量免疫荧光试验证实衣原体存在着属、种、亚种和型特异性抗原。在这些抗原特性的研究中发现:属特异性抗原的化学成份为脂多糖(LPS),对热稳定,用蛋白酶K处理不能破坏其与特异性抗体的反应,而用过碘酸钠处理则能阻止这种反应。种和亚种特异性抗原成     

抗狂犬病病毒核蛋白单链抗体的表达及活性鉴定

为了获得抗狂犬病病毒(RV)核蛋白(N)的单链抗体,从分泌抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D9中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因,利用重叠引物延伸法将轻链可变区基因和重链可变区基因连接,同时引入连接肽编码序列,成功扩增得到单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后得到融合蛋白。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,融合蛋白大小约为32ku,主要以包涵体的形式存在,能被抗His标签的单克隆抗体特异性识别。间接竞争ELISA检测结果表明,该单链抗体能够与RV-His-N重组蛋白和RV结合。抗RV核蛋白单链抗体的成功表达,为单链抗体在狂犬病的诊断和治疗中的进一步研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其应用

为制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)单克隆抗体(MAb)及其直接荧光标记抗体,本试验用纯化的牛病毒性腹泻病毒Ht01株免疫雌性BALB/c小鼠。间接ELISA测其血清效价,取抗体效价达标小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行2次亚克隆后注射入小鼠腹腔制备单抗腹水。利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水,用间接免疫荧光试验测定其活性,用SDS-PAGE试验测定其纯度。经活性、纯度检测合格后,采用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联;用葡聚糖G-25 Medium介质进行分离纯化。结果,本研究共获得2株能够稳定分泌IgG1类型的阳性杂交瘤细胞株和一种直接荧光抗体,分别被命名为BMAb11、BMAb20、DB11。稳定性试验表明,杂交瘤细胞分泌的抗体稳定性好。ELISA、间接免疫荧光试验和直接免疫荧光试验表明,单克隆抗体和直标荧光抗体均与BVDV发生特异性反应,说明它们的特异性较好。经ELISA鉴定,腹水抗体效价达到1∶12 800。直接荧光抗体荧光素与蛋白的摩尔比(F/P)为3.34,标准值在2.0～4.0之间,符合标准。上述研究结果表明,本研究制备的单克隆抗体和直标荧光抗体可用于BVDV的检测,为BVDV的临床诊断奠定了基础。     

杂交瘤技术与单克隆抗体在兽医上的应用

最近几年,生物技术(或称生物工程)取得许多重大突破性发展,特别是基因工程和细胞工程技术的建立和应用。细胞工程当前重点开发的是细胞融合技术和细胞培养技术,其中最引人注目的是淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体。 1975年,英国人Kohler和Milstein创建淋巴细胞杂交瘤技术,确立体外能够大量生产纯粹蛋白抗体的新途径。在短短几年内,由浅入深,发展迅速,已广泛地用于医学领域的免疫学、     

抗小反刍兽疫病毒P蛋白单链抗体的制备及鉴定

为制备抗小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株P蛋白的单克隆抗体并获得其单链抗体(ScFv)基因,利用纯化的PPRV和带有GST标签的重组P蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗PPRV P蛋白的单克隆抗体(m Ab),从分泌抗PPRV P单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,扩增VH基因和VL基因,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法获得单链抗体全长基因,并克隆至原核表达载体p ET32a(+)中,再将构建的重组质粒p ET32a-ScFv-3A6转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导单链抗体重组蛋白表达。结果,获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株3A6、1P4、3F8和1P1,对m Ab 3A6进行了Western-blot鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)。成功扩增了杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,获得了ScFv-3A6重组蛋白,大小为47 ku,证实该重组蛋白具有较强的抗原结合活性。上述研究结果表明,本研究获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,并成功扩增到杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,实现了原核表达,为PPR防控新措施的研究奠定了基础。     

蓝舌病病毒NS2蛋白单克隆抗体的制备及其应用

本研究旨在制备针对蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)非结构蛋白NS2的单克隆抗体,进而用于C-ELISA鉴别BTV自然感染动物与BTV灭活疫苗免疫动物。通过原核表达BTV NS2蛋白的高保守多肽(1~228 aa)来制备抗原,并通过免疫BALB/c小鼠制备抗BTV NS2蛋白的单克隆抗体,结果,获得1株分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞,命名为BTV-2A4。鉴定结果显示,该单克隆抗体的亚类/亚型为IgG1/κ;其抗原表位在NS2蛋白的91~138 aa区间;能特异性地与1~24型BTV的NS2蛋白反应;可应用于Western-blot、间接免疫荧光、间接ELISA及C-ELISA技术。C-ELISA应用的试验数据表明,BTV疫苗免疫动物及未被BTV感染动物的血清中检测不到NS2抗体,而BTV感染动物的血清中大多可被检出NS2抗体。     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其特性研究

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因疫苗和重组E2蛋白分别免疫BALB/c小鼠,制备了5株单克隆抗体(4G3、3B2、3F8、2H6、3A11),并对这些单克隆抗体的亚类、免疫原性及其与瘟病毒的反应性进行了检测.结果显示,4G3、382、3F8、2H6为IgM类抗体,3A11为IgG类抗体;纯化后的单克隆抗体与纯化前比较,与抗原的反应性略有提高;5株单克隆抗体与BVDV和猪瘟病毒(CSFV)均有交叉反应性.表明,制备的5株单克隆抗体所针对的是BVDV和CSFV共有的抗原表位.     

鼠伤寒沙门菌延伸因子EF-Tu蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备鼠伤寒沙门菌延伸因子Tu(EF-Tu)的单克隆抗体,以原核表达并纯化的鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与SP2/0融合,以间接ELISA筛选出阳性克隆,经5次亚克隆后获得5株稳定分泌抗EF-Tu蛋白抗体的杂交瘤细胞株,遂将其命名为Tu1-A1、Tu1-C4、Tu1-H2、Tu4-C11、Tu9-B9。对这5株单克隆抗体的初步鉴定结果表明,其抗体亚型均为IgG1/κ型。以原核表达的带GST标签的EF-Tu蛋白做Western-blot检测制备的单克隆抗体,证实所制备的单克隆抗体具有良好的反应性。这些单克隆抗体的制备为后期研究EF-Tu蛋白在沙门菌侵入及胞内存活过程中的调控作用奠定了基础。     

鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1β亚基单克隆抗体的制备和鉴定

为制备鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1β亚基(PDHB)的单克隆抗体,将鸡毒支原体Rlow株的pdhb基因进行克隆和原核表达。表达产物纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗鸡毒支原体PDHB抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为2D11、3B5和4D9。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024~1∶2 048,小鼠腹水的抗体效价为1∶12 800~1∶25 600。单克隆抗体特异性试验显示,获得的腹水单克隆抗体均能与鸡毒支原体各菌株发生反应,而不与其他禽类病原发生反应。3株单克隆抗体的抗体亚型均为IgG1,轻链均为κ链。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。鸡毒支原体PDHB单克隆抗体的成功制备,为研究丙酮酸脱氢酶的生物学功能和进一步建立检测方法奠定了基础。     

克伦特罗单克隆抗体的制备与鉴定

将克伦特罗(Clenbuterol)重氮化后与牛血清白蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术获得1株稳定分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该单克隆抗体为IgG1亚类,用间接ELISA测定细胞上清液抗体效价为11.6×106,腹水抗体效价为13.2×108.抗体与沙丁胺醇无交叉反应.该细胞株体外传代培养和冻存复苏后仍能稳定分泌抗体.     

PEDV双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为了快速检测猪流行性腹泻病毒,本研究以纯化的家兔抗猪流行性腹泻病毒多隆抗体为捕获抗体,以小鼠抗猪流行性腹泻单克隆抗体为检测抗体,并对单克隆抗体进行HRP标记,由此建立了双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测法,检测抗体的最佳工作浓度为浓度为0.75ug/m L。当D450≥0.233且P/N≥2时判定为阳性。该方法特异性强,与猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒均无交叉反应,最低检测量为3.125×10~3TCID_(50)/m L。该方法重复性较好:批间和批内重复率均小于10%,临床样品检测结果与RT-PCR方法比较,符合率为90.5%。上述结果表明,本研究建立的检测猪流行性腹泻病毒的双抗体夹心ELISA特异性强、灵敏度高,可用于对猪粪样中PEDV的检测。     

猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用

为建立一种简便、快捷、特异、敏感的猪瘟病毒(CSFV)E2抗体的胶体金检测方法,本研究将E2蛋白用胶体金颗粒标记,作为金标抗原,将E2蛋白及其单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),组装成检测猪瘟E2蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条.结果 显示,该试纸条可在5～10 min完成检测...     

猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其免疫组织化学研究

通过杂交瘤技术制备猪瘟病毒单克隆抗体,对酶联免疫吸附试验筛选的阳性单克隆抗体进行免疫组织化学研究,从中发现1株单克隆抗体能与感染猪瘟病毒的猪肾、肝病理组织切片及PK15细胞产生特异性染色反应,与非感染猪的肾、肝组织切片和PK15细胞无染色反应。单克隆抗体与猪瘟病毒感染的PK15细胞或猪肝、肾小血管内皮细胞中的猪瘟病毒呈现较强的特异性棕色着染,表明该单抗是针对猪瘟病毒的单克隆抗体,对研究猪瘟病毒在宿主细胞中的生命活动和繁殖定位有非常重要的意义。该单抗命名为YNF,培养上清液和腹水的抗体效价分别为1∶80和1∶10 000。抗体蛋白属IgG类,亚类为IgG2/κ。     

分泌抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立——体外免疫法制备免疫脾细胞

作者用纯化弓形虫速殖子可溶性抗原体外免疫BALB/C小鼠的正常脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ABC—ELISA和IHA筛选和3次克隆化培养后获得了1株分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞(E5)。E5杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经琼脂双扩散免疫试验确定为IgGl亚类抗体。单克隆抗体的抗原吸收试验结果证明E5单克隆抗体为抗弓形虫特异性抗体。E5杂交瘤细胞的染色体数目为92～108,经连续30代传递培养和4个月冻存复苏试验证明其分泌特异性单克隆抗体的性能相当稳定。初步证实E5单克隆抗体针对一种弓形虫的共同抗原成份。     

猪细小病毒1型VP2蛋白的表达与单克隆抗体的制备及应用

为研制抗猪细小病毒1型(PPV1)VP2蛋白的单克隆抗体,用重组杆状病毒表达的PPV1VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,融合后采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验筛选抗PPV1VP2的单克隆抗体阳性细胞株,并对单克隆抗体的腹水效价、免疫反应特性及亚类进行了系统鉴定。结果显示,共获得8株阳性杂交瘤细胞株,其腹水抗体效价均达1∶51 200,其中7株的重链亚类为IgG1,另1株(4A1)为IgM;6株的轻链为κ型,另2株(8D7和4A1)为λ型。这些单克隆抗体均可与PPV1感染的猪睾丸细胞呈阳性反应;Western-blot结果显示,这些单克隆抗体可与自然PPV1VP2蛋白产生良好的免疫反应。以其中1株单克隆抗体(8E4)建立了间接ELISA,通过对重组杆状病毒表达的PPV1VP2蛋白产物进行的动力学检测表明,第72小时蛋白表达量最高;对PPV1感染细胞增殖规律的测定结果显示,接种后第16小时可检测到病毒感染的阳性细胞,说明该病毒复制周期小于24h。本研究获得的单克隆抗体可用于重组VP2蛋白抗原的检测及病毒繁殖规律的研究。     

新型抗体的研究概况

新型抗体是利用生物技术改建和生产的抗体,是近年生物技术研究的一个崭新领域。新型抗体的出现,既扩展了抗体的界限,又延伸了抗体的应用范围,其研究结果不仅显示出重要的理论价值,而且在疾病的预防和诊疗上的意义也日趋明显。目前,已研制和正在研制的新型抗体,大致可归纳成两大类——重组型抗体和新功能型抗体。(一)重组型抗体利用基因工程技术改建生产的抗体,其生物活性仍保持原抗体活性,主要包括有单链抗体、嵌合抗体和重构抗体等。1.单链抗体(Single chain antibody):该抗体由全抗体的部分重链和轻链的可变区,通过一连接肽(约15～25个氨基酸)共价连接起来的重组分子。1988年美国Genex Corp公司的Bird等首先研制出这种抗体。他们在弄清牛生长激素的McAb重链和轻链基因序列的基础上,通过计算机处理抗体X晶体显像,算出可变区三维空间结构及两条链的自然结合状态,设计出编码两个可变区肽段和一个连接肽的融合基因,插入载体,在E.co-li中获得表达。单链抗体是抗体的最小结构单位,     

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的抗原结合特性分析

为了解和确定抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体所针对的抗原表位及今后的确切用途,用竞争性结合ELISA试验结合Western-blotting分析,对10株单克隆抗体的抗原结合特性进行了分析。抗体反应增值结果表明,10株单抗针对的是同一大的抗原决定簇,根据增值结果可将10株单抗分成4个亚群。除2A1外,其他9株单抗的ELISA反应增值结果与Western-blot- ting分析结果一致,认为可能是由于2A1与其他9株单抗的免疫原不同所致。     

马立克氏病病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得分泌抗鸡马立克氏病病毒(MDV)gE囊膜糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将pGEX-6P-1表达的重组蛋白gE作为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,共筛选获得4株能够稳定分泌抗MDV gE蛋白抗体的杂交瘤细胞株。抗体亚型鉴定结果表明,4株均为IgG1型,轻链为κ链。间接免疫荧光结果显示,4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能特异性识别MDV,并具有一定的中和活性。本研究对MDV诊断、抗原表位分析及鉴定等具有重要的应用价值。     

H5亚型禽流感病毒反应原性差异及ELISA检测方法的研究

在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,建立了H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法。通过分析不同单克隆抗体与不同禽流感毒株的反应性差异,筛选高特异性和高敏感性的H5亚型单克隆抗体。优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶标抗体的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与斑点ELISA、H5N1多重RT-PCR或病毒分离鉴定的结果相比较,同时使用该方法对野外样品进行了检测。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒。