耐氟喹诺酮类药物大肠埃希氏菌基因突变的MAMA-PCR检测

采用MAMA-PCR法对72株已知突变菌株的突变情况进行了检测。结果,有2种gyrA 83位突变:TCG→TTG和TCG缺失;4种gyrA 87位突变:GAC→AAC、GAC→GGC、GAC→TAC和GAC→CAC;1种parC 80位突变:AGC→ATC以及4种parC 84位突变:GAA→AAA、GAA→GCA、GAA→GGA和GAA→GTA。采用同样的方法,对38株未知突变菌株的检测结果显示,gyrA 83、gyrA 87、parC 80和parC 84位的突变检出的正确率分别为97．4％、94．7％、81．6%和94．7％。结果表明,MAMA-PCR有望成为监测耐氟喹诺酮类药物大肠埃希氏菌的分子生物学常规方法。     

鸡毒霉形体耐氟喹诺酮类gyrA基因的突变特征

按常规方法提取鸡毒霉形体 3株临床分离株和参考株 (S6 - 10 )的基因组DNA ,扩增各菌株DNA旋转酶gyrA基因片段 ,并克隆、测序 ,用DNAsis软件对测序结果进行分析。结果表明 ,HS1、HS2株均在GyrA亚基第 87位发生了Glu87→Gly氨基酸取代 ,除此之外 ,耐药水平较高的HS2株还在第 83位发生了Ser83→Ile氨基酸取代 ,而FL分离株虽对氟喹诺酮类药物产生了低水平耐药 ,但在GyrA亚基未发生任何氨基酸突变。     

体外耐氟喹诺酮类鸡毒霉形体gyrA基因的突变特征分析

按常规方法提取了鸡毒霉形体参考株S6 10 、疫苗株F14 8及在氟喹诺酮类药物压力下筛选出来的耐药株的基因组DNA ,扩增了各菌株DNA旋转酶 gyrA基因片段 ,并进行了克隆、测序 ,利用DNAsis软件对测序结果进行分析。结果表明 ,S6 10 和F14 8在恩诺沙星或环丙沙星压力下均筛选出不同程度的耐药菌 ,而且恩诺沙星致鸡毒霉形体发生耐药性突变的几率高于环丙沙星 ,S6 10株耐药突变频率高于F14 8;S6 10 筛选出来的耐药菌株发生突变的位置在DNA旋转酶GyrA亚基的第 83位 (相对于大肠埃希氏菌GyrA亚基中的位置 ,以下同 )和第 87位上 ,取代模式分别为Ser→Ile、Glu→Gln ,另外 1株高水平耐药株 (Se10 ,MIC≥ 12 8)在第 10 3位也发生了氨基酸取代 (Ile→Val) ;F14 8筛选出来的耐药菌株只在DNA旋转酶GyrA亚基的第 87位发生了突变 (Glu→Gly/Gln)。     

用于诊断4种猪病毒病的寡核苷酸芯片的研制

制备可同时检测引起集约化养猪业常见4种传染病,病毒(猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳)的寡核苷酸芯片。根据4种猪疫病病毒特异性基因的保守区域设计合成了60 mer寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片。采用不对称PCR和间接荧光标记技术进行单链DNA扩增和荧光标记,标记样品与寡核苷酸芯片杂交后,进行芯片清洗、扫描及结果分析。杂交结果显示,4种病毒的寡核苷酸检测探针均特异地与相应的标记样品杂交,芯片上呈现较强的阳性杂交信号,而除阳性质控探针外,阴性对照和空白对照均检测不到荧光信号。证明寡核苷酸芯片适用于快速、准确、高通量地诊断影响集约化养猪业的多种猪疫病病毒。     

嗜水气单胞菌gyrA氟喹诺酮抗性决定区的克隆与分析

研究了从病鱼体内分离的嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药性的分子机理。以 4株对诺氟沙星等氟喹诺酮类药物耐药菌株及 2株敏感菌株为模板 ,参照杀鲑气单胞菌gyrA基因序列 ,设计了 1对引物 ,进行 gyrA基因氟喹诺酮抗性决定区PCR扩增 ,将扩增产物克隆入pMD1 8 T载体 ,转化入大肠埃希氏菌DH5α中 ,小提质粒 ,酶切鉴定 ,测序并分析比较耐药菌和敏感菌的氨基酸残基序列 ,发现耐药菌有 5个氨基酸突变位点 ,分别是 83位点的Ser→Ile,92位点的Leu→Met,1 74位点的Ile→Phe,2 0 2位点的Asn→Asp ,2 0 3位点的Leu→Arg ,耐药菌突变后的氨基酸残基均比敏感菌正常的相对应氨基酸残基分子量大。 83位点的突变与大肠埃希氏菌的耐药性突变一致 ,1 2 2位点具有保守的Try。     

耐氟喹诺酮类药物空肠弯曲菌HRM快速检测方法的建立

针对空肠弯曲菌介导氟喹诺酮类耐药决定区gyrA基因C-257-T位点突变,探讨高分辨率熔解曲线技术对其检测的可行性。选择gyrA基因已经被测序的菌株NCTC11168和ZP11作为高分辨率熔解曲线法的标准阴性和阳性菌株,建立评价高分辨率熔解曲线方法的阴性和阳性标准。利用该技术对已知氟喹诺酮类耐药表型的55株菌株进行检测,结果45株与耐药表型鉴定结果一致,准确率达到81.81%。高分辨率熔解曲线技术检测耐氟喹诺酮类药物空肠弯曲菌gyrA基因C-257-T位点突变具有简单、快速、无污染等优点,有望成为临床检测筛选高耐氟喹诺酮类药物空肠弯曲菌的优选方法。     

五种重要致病性弧菌高通量液相芯片检测方法的建立

为建立一种快速、准确同时检测5种致病性弧菌的高通量液相芯片技术,本研究针对霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌的10个目的基因,包括5个种特异性基因和5个毒力基因,分别设计特异性引物和探针,多重PCR扩增后的产物与偶联有不同核酸探针的微球混合物进行杂交反应,利用液相芯片检测仪分析结果.结果显示,本方法同时...     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒液相芯片检测方法的建立

为应用液相芯片技术建立同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,在GenBank中收集H5、H7、H9亚型AIV的HA基因序列,利用DNAMAN软件分析比较筛选出特异的保守片段,设计引物和探针。将多重不对称RT-PCR扩增产物与偶联荧光微球的探针进行杂交,建立多重液相芯片方法。结果显示,多重液相芯片技术对H5、H7、H9亚型AIV核酸的最低检出量分别为18.5、28.7、20.7pg/μL,检测的特异性和重复性都很好,应用该方法和禽流感检测试剂盒双盲试验同时对50份已知病毒的样品进行了检测,两者符合率为100%。该方法为禽流感病毒核酸液相芯片的进一步研究奠定了基础。     

用于检测仔猪致病菌的23S rRNA基因芯片的研制

以副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、猪链球菌等12种仔猪致病菌为目标细菌,23SrRNA基因为靶基因,从GenBank中下载其23SrDNA全序列,在其变异区设计特异性探针,在保守区设计通用引物。通过序列分析、PCR靶标与探针杂交试验,建立了有13条寡核苷酸探针和2对通用引物的仔猪常见致病菌基因芯片检测方法。以参考菌株粗提基因组DNA的10倍系列稀释模板做PCR,扩增产物与探针杂交,检出芯片的灵敏度为100fg。对33个参考菌株用芯片检测,结果有1例不正确,只鉴定到属;在61个野外分离株中,55株的芯片检测结果与生化或测序结果一致,有6例不一致,符合率为90%。初步研究证明,该检测方法能快速、有效地鉴定多种仔猪常见致病菌,但要区分某些细菌的致病株与非致病株,还要检测毒力/毒素基因。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒及鉴别类NADC30毒株的双重荧光定量PCR方法

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）保守区和类NADC30毒株的双重TaqMan探针荧光定量PCR方法,分别针对保守的N蛋白基因和Nsp2基因设计特异性引物和探针,通过优化反应体系及反应条件对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估。结果显示,双重标准曲线的相关系数（R2）均大于0.990,具有良好的线性关系;最低检测限分别为5.27 copies/μL和3.00 copies/μL,具有较高的灵敏度;不与其他常见猪病病原发生非特异反应,且重复性良好,批内批间变异系数均小于3%。对168份临床样本的检测结果显示,PRRSV总阳性检出率为68.45%(115/168),其中类NADC30检出率为32.14%,混合感染率为20.24%,与临床诊断结果相一致。结果表明,本方法可用于检测PRRSV和鉴别类NADC30毒株以及猪繁殖与呼吸系统综合征的流行病学调查。     

H1N1和H3N2亚型流感病毒基因芯片检测方法的建立

为建立同时能鉴别甲型H1N1和猪流感病毒常见亚型的新型基因芯片检测方法,根据GenBank中已发表的甲型流感病毒MP的基因序列和甲型H1N1(2009)和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型的基因序列,设计、筛选并合成7对特异性引物和1对通用引物;根据扩增的靶序列,设计并合成14条特异性探针和3条质控探针,制备了甲型H1N1(2009)流感病毒和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型基因芯片;并进行了特异性试验、敏感性试验和田间样品的检测。结果显示,该芯片检测方法与猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病毒无交叉反应;对猪H1N1、猪H3N2和甲型H1N1(2009)流感病毒而言,最低可检测到105、104和105稀释的病毒株。结果证实,该方法特异性强、敏感性高,是一种高通量的甲型H1N1和猪流感常见亚型筛查方法。     

用寡核苷酸探针对近交系小鼠DNA指纹图谱的分析

应用DNA指纹技术 ,用非放射性标记的寡核苷酸探针 (GGAT) 4对 3个清洁级近交小鼠品系C5 7、DBA/ 2、BALB/c进行检测 ,分析其DNA指纹图谱。结果显示 ,不同品系近交系小鼠的DNA指纹图谱有明显差异 ,而品系内小鼠之间的DNA指纹图谱基本一致。证明DNA指纹技术能够较好地检测出近交系小鼠的基因纯合性 ,反映其遗传质量 ,可以应用于对近交系小鼠的遗传质量监测。     

痢疾杆菌福氏2a及其环丙沙星耐药株gyrA和parC基因耐药性决定区序列的测定分析

测定了痢疾杆菌福氏 2a 30 1株与喹喏酮类药物耐药性相关的 gyrA基因和 parC基因的序列 ,并对其环丙沙星耐药诱变株的 gyrA和 parC基因喹喏酮类药物耐药性决定区 (QRDR)序列进行了测定分析。结果表明 ,痢疾杆菌福氏 2a 30 1株 gyrA和 parC基因分别为 2 6 2 5bp和2 2 5 6bp ,环丙沙星诱导的耐药菌 gyrA基因QRDR(2 4 5bp)发生氨基酸残基 6 9 Ala→Val和 87 Tyr→Asp改变 ,parC基因QRDR(2 37b)发生氨基酸残基 79 Ala→Asp、84 Ala→Glu和 85 Pro→Ala改变。这一研究结果对认识痢疾杆菌喹喏酮类药物耐药性的分子机理具有重要意义     

鸡传染性腺胃炎病原的分离鉴定

河北省某个体户蛋用种鸡场连续孵化出的7批海赛商品雏鸡共6万余只,在30～80日龄时发生一种以极度消瘦、腺胃肿大为特征的疾病.采集发病鸡的腺胃进行病原分离鉴定,从中分离出传染性支气管炎病毒(IBV).将发病鸡的腺胃匀浆乳剂及第5代鸡胚分离物接种SPF鸡,结果用鸡腺胃匀浆乳剂接种的鸡出现了与自然病鸡相同的临床症状,而用第5代鸡胚分离物接种的鸡未能复制出腺胃肿大病例.取各接种组鸡血清进行17种相关病原抗体检测,结果接种病鸡腺胃匀浆乳剂的鸡检出了网状内皮组织增生病病毒(REV)抗体.初步试验结果表明,此次发生的以腺胃肿大为特征的疫病可能与REV感染有关,而所分离到的IBV本身并不能引起腺胃肿大.     

应用Dot-ELISA检测牛胴体沙门菌

应用Dot ELISA法对西宁市某屠宰点 71份牛胴体淋巴结进行了沙门菌检测 ,同时与常规分离培养鉴定技术比较。结果 ,在 71份牛胴体样本中 ,用Dot ELISA法检出沙门菌阳性 33份 ,阳性率为 4 6 .4 8% (33/71) ;而用常规分离培养鉴定技术检出沙门菌阳性 31份 ,阳性率为 4 3.6 6 %(31/71) ;2种方法的阳性符合率为 81.82 % ,阳性检出率差异不显著 (P >0 .0 5 )。