蓝舌病毒核酸杂交技术的研究

核酸杂交技术的出现为蓝舌病(BT)的诊断开拓了一个新纪元,它是检测蓝舌病毒(BTV)既快速又敏感的方法。本技术不依赖于病毒分离与鉴定,而是直接检测蓝舌病毒的基因片段,具有很高的特异性。我们应用〔γ~(-32)p〕ATP末端标记BTV全基因组,进行打点杂交和Northern印渍转移杂交,以期建立BTV的核酸杂交诊断技术。本试验结果令人满意。     

原位PCR技术及其应用

1969年 ,Pardue等建立了核酸分子的原位杂交技术 (ISH) ,该技术能对细胞或组织内的核酸或病毒进行定位和检测 ,不仅灵敏性高而且具有准确的定位能力。但是 ,由于其只能对靶序列丰富的细胞或组织进行检测和定位 ,对低拷贝基因和单拷贝基因则无能为力 ,所以ISH的应用受到很大的限制。1985年出现的聚合酶链反应具有很高的灵敏性和特异性 ,理论上可以检测出仅有 1个病毒颗粒的细胞 ,但是该方法只能在液体状态下使用 ,需要对细胞或组织破碎以提取DNA或RNA ,也不能对细胞或组织中的病毒或基因进行定位。为了能够检测细胞或组织中的低拷贝和…     

斑点印迹杂交技术测定牛疱疹病毒核酸序列

在斑点印迹、核酸杂交的基础上,R.H.Andin。等利用~(32)P标记、切口平移和质粒探针的方法建立了一种检测牛疱疹病毒1型阿根廷分离株的敏感和特异的方法。该探针包含病毒基因组左侧的克隆Bam H1限制性片段。该方法检测灵敏度为10pg病毒DNA。     

光生物素标记六邻体蛋白基因探针检测减蛋综合征病毒的研究

根据基因文库中减蛋综合征病毒 (EDSV)AV12 7株的序列设计 1对引物 ,从四川本地分离的EDSVSG930 1株中扩增出六邻体蛋白基因并将其克隆到PUC1 8的多克隆位点中 ,经PCR、酶切分析、DNA杂交分析和序列测定证明 ,所扩增、克隆的基因包括了六邻体蛋白基因从起始密码子到终止密码子在内的完整序列。用光生物素对含六邻体蛋白基因的重组质粒标记后 ,采用斑点印迹法对 4株EDSV(标准株AV 12 7株和 3株四川分离株 )、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸭瘟病毒的核酸进行检测 ,结果 ,该探针能检测出 4株EDSV ,但不能检出新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸭瘟病毒。表明该六邻体蛋白基因探针具有特异性 ,检测的灵敏度高达 12pg。     

产蛋下降综合征病毒PCR检测方法的建立

根据已报道的腺病毒DNA序列 ,设计合成了 1对核苷酸引物 ,引物间隔约 63 0bp。用该引物对EDS76病毒内蒙古分离株 (N3 ,N4 )和参考株 (AV 1 2 7)核酸进行聚合酶链式反应 (PCR)。结果 ,均扩增出了约 63 0bp的特异性DNA片段。所建立的PCR方法可检出 1 0 0pg的样品模板。结果表明 ,此PCR方法是检测EDS76病毒的一种简便快速、特异性强和灵敏度高的方法     

塞内卡谷病毒荧光RT-RPA快速检测方法的建立

本研究利用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术建立快速检测塞内卡谷病毒(SVV)的实时荧光RT-RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,能准确检测SVV核酸,与水泡性口炎病毒(VSV-IND和VSV-NJ)、猪水泡病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测SVV核酸浓度为1.35×10~(-3)g/mL;简便快速,反应时间小于20 min;重复性好。利用所建立方法对116份临床样品进行检测,结果与实时荧光RT-PCR一致。本研究为SVV防控提供了一种快速检测的新方法,可用于基层实验室对SVV的快速检测。     

基因探针在诊断微生物学的应用

对许多微生物来说,常用的普通培养分离法颇费时日,不能快速地做出临床诊断。而应用标记的基因探针,通过DNA杂交,以定位微生物染色体DNA特殊区段的基因,就可以确定受感染组织中是否存在该微生物的特殊基因组,不仅可以快速地检测出活的病原体,而且可发现有缺陷的病毒粒子和易于发生抗原变异的血液寄生物(Lee等,1985)。由于基因探针的同源性特点,不像多克隆抗体或单克隆抗     

猪瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了猪瘟病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果,根据猪瘟病毒5′端非编码区的一段保守序列设计的LAMP引物能够在65℃下1h内实现目标核酸区段的大量扩增,检测结果可直接用肉眼判断。结果表明,该检测体系具有极高的特异性,只能检测到目标病毒,与其他类似病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的核酸等无交叉反应,可检测到1×10-3稀释度的目标病毒核酸量,比普通RT-PCR的灵敏性高10倍。     

非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×10~2copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10～20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。     

聚合酶链反应检测猪细小病毒的研究

利用聚合酶链反应(PCR),对从猪细小病毒(PPV)三株强毒及 两株弱毒的细胞培养产物中提取的核酸进行扩增。通过琼脂糖电泳,均得到了约158bp(碱基对)的特异性核酸片段。与该病毒本身的二个含20bp的寡核苷酸引物之间的核酸长度相等。而对与PPV具有基因同源性的犬细小病毒(CPV)及与PPV临床症状相似的非相关病毒如日本乙型脑炎病毒(JEV)、伪狂犬病毒(PRV)作同样处理,未得到核酸带。并且通过筛选裂解蛋白的方法,建立了一种快速提取DNA的方法,初步制定了快速检测PPV的程序。     

几种动物病毒的基因芯片检测技术

分别用水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段构建质粒 ,在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸 ,经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果扫描检测 ,可同时对上述 7种动物传染病进行快速、准确的诊断 ,此方法敏感性高 ,特异性强 ,适合于大批动物高通量检疫。     

非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组中序列保守稳定的B646L基因设计特异性引物和探针,建立了敏感、特异、高效的ASFV核酸RPA快速检测法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测ASFV核酸,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等灭活病毒核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到2×101copies/uL;检测时间短,15 min即可完成反应;重复性好。采用ASFV灭活抗原和猪血液制备模拟临床猪血样品,能检出灭活抗原的稀释度为1∶12 800,应用该方法对200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血进行检测,结果均为阴性,与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。本研究建立的RPA快速检测法操作简便,尤其适合ASFV现场快速检测。     

病毒病诊断新技术——聚合酶链反应

对病毒病的诊断主要依靠从病料中直接检出病毒或间接检出抗病毒抗体的方法,其包括:病毒的分离培养、电子显微镜观察和免疫学方法。近年来,人们应用核酸杂交技术直接检测病毒,即用标记核酸探针和靶病毒基因互补结合,通过检测标记物以达到诊断的目的,用该法检测时至少需要10~4～10~5个靶基因拷贝。由于有些病毒在数量很少的情况下可使宿主发病;有些病毒在感染早期病毒数量甚微,又无免疫     

用生物素标记核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究

将纯化的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)全基因组用缺口翻译方法把生物素—尿苷三磷酸(Biotin-dUTP)掺入双链IBRV—DNA上作为探针,与点在硝酸纤维膜上的样品进行打点杂交,然后在链霉亲合素—碱性磷酸酶中孵育,用氮蓝四唑和5—溴—4—氯—3—吲哚磷酸作用,阳性反应呈现紫色斑点。通过检测样品中IBRV—DNA同源序列,以确定是否存在IBRV。结果表明,应用生物素核酸探针可检出10pg的IBRV—DNA,具有灵敏、快速、无放射性污染、探针保存时间长等优点,为IBRV临床检测提供了一个有力的手段。     

多聚酶链式反应技术及其在畜牧兽医领域的应用

近20年来,随着一系列新技术的出现及改进,分子生物学领域已发生了一场深刻的革命。这些新技术包括用各种DNA修饰酶(如DNA限制性内切酶及DNA连接酶)对DNA进行切割和连接,用质粒、病毒等作载体对特异性的DNA进行克隆和大量扩增,DNA顺序分析,核酸杂交及DNA化学合成等。新近又产生了多聚酶链式反应技术(polyme-rase chain reaction,PCR)。该技术自1985年首次报道以来,到目前为止采用它进行的研究已超过600项。本文将介绍该技术的原理,主要过程及在畜牧兽医领域的应用前景。     

应用PCR检测山羊痘病毒

初步建立了用于诊断山羊皮肤组织中山羊痘病毒的PCR方法。试验设计了 2对引物 ,用以分别检测山羊痘病毒的特异性基因和α 微管蛋白基因。克隆到的DNA扩增产物的序列与GenBank中收录的序列同源性达到 98%。试验表明 ,用PCR方法可快速检测样品中的山羊痘病毒。     

核酸探针制备方法简介

随着分子生物学的飞速发展,利用核苷酸碱基配对原理建立的核酸杂交技术已广泛地应用于分子生物学、医学和兽医学的各个领域。核酸杂交技术的应用使疾病诊断由检测体内正常、异常成份变化的理化诊断方法和检测抗原-抗体反应的免疫学诊断方法发展到了基因诊断水平,从而使疾病的诊断更为准确、可靠。核酸杂交技术中,常用放射性同位素(~(32)P、~3H、~(35)S、~(14)C)或其它标记物(半抗原、酶、生物素)标记特异核苷酸片段来制备核酸探针。现将常用核酸探针制备的方法作如下简介。     

羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒(CaPV)末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法.结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性.与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性.表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测.     

新城疫病毒传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒共检基因芯片的构建

本试验在前期研究的基础上,进一步构建了联合检测新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因芯片。克隆和鉴定了NDV-F、NDV-HN、IBV-M、IBV-N、ILTV-TK、ILTV-gB共6个基因,将其特异cDNA/DNA片段作为靶基因点制于氨基修饰的玻片上,制备了NDV-IBV-ILTV共检基因芯片阵列。以这3种病毒的核酸作为模板,引入Cy3-dCTP进行探针的PCR扩增标记,标记产物与芯片杂交,进行基因芯片的有效性评价,同时对该芯片的特异性、敏感性和稳定性进行了评价,并进行了临床初步检测验证。结果,确定了NDV-IBV-ILTV共检芯片的探针PCR扩增标记体系,确定Cy3-dCTP终浓度为100μmol/L;以禽流感病毒和传染性囊病病毒为模板制备的探针不与NDV-IBVILTV芯片杂交,NDV、IBV、ILTV之间无交叉反应;该芯片检测的灵敏度为20pg/μL;随机抽取3张不同批次制备的芯片,与NDV-F和NDV-HN的杂交结果显示,SNR均大于3。分别用该基因芯片和PCR/RTPCR检测了12份临床病料,结果显示,NDV检出率为16.67%,IBV检出率为41.67%,ILTV检出率为0,两者的检测结果一致。结果表明该检测技术能够用于NDV、IBV和ILTV快速诊断和临床病料的检测。     

用于诊断4种猪病毒病的寡核苷酸芯片的研制

制备可同时检测引起集约化养猪业常见4种传染病,病毒(猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳)的寡核苷酸芯片。根据4种猪疫病病毒特异性基因的保守区域设计合成了60 mer寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片。采用不对称PCR和间接荧光标记技术进行单链DNA扩增和荧光标记,标记样品与寡核苷酸芯片杂交后,进行芯片清洗、扫描及结果分析。杂交结果显示,4种病毒的寡核苷酸检测探针均特异地与相应的标记样品杂交,芯片上呈现较强的阳性杂交信号,而除阳性质控探针外,阴性对照和空白对照均检测不到荧光信号。证明寡核苷酸芯片适用于快速、准确、高通量地诊断影响集约化养猪业的多种猪疫病病毒。