用蔗糖密度梯度离心法纯化小球隐孢子虫卵囊试验

用蔗糖密度梯度离心法从接种犊牛粪便中纯化小球隐孢子虫卵囊,该方法操作简便、快速、经济、获得的卵囊纯度高,回收率达92.0%,适合于国内普通实验室使用.     

三种不同寄生部位隐孢子虫卵囊体外脱囊条件的比较

为研究不同寄生宿主及不同寄生部位隐孢子虫的生物学特性,以安氏隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫和人隐孢子虫为研究对象,分别选择在PBS和7.5g/L胆酸盐溶液中水浴脱囊的方法比较上述4种隐孢子虫卵囊脱囊率,并进一步比较贝氏隐孢子虫卵囊在不同温度及脱囊液中的脱囊率。结果显示,胃腺寄生类群安氏隐孢子虫在37℃PBS中即有较高脱囊率,与在37℃7.5g/L胆酸盐溶液中相比差异不显著(P0.05)。肠道寄生类群微小隐孢子虫和人隐孢子虫在37℃PBS中脱囊率极低,而在37℃7.5g/L胆酸盐溶液中脱囊率显著升高(P0.01)。贝氏隐孢子虫在37℃PBS中有一定脱囊率,与在37℃7.5g/L胆酸盐溶液中的脱囊率接近(P0.05),提高脱囊温度至40℃,则脱囊率显著升高,并且在PBS和7.5g/L胆酸盐溶液中脱囊率差异显著(P0.05),但增加胆酸盐浓度不能提高其脱囊率(P0.05)。结果表明,胃腺寄生类群在合适温度即有较高脱囊率,而肠道寄生类群则不仅需要合适的温度还需要合适的脱囊液。贝氏隐孢子虫卵囊对脱囊条件要求更接近于胃腺寄生类群,这对进一步了解隐孢子虫生物学特性及体外培养研究有借鉴意义。     

隐孢子虫病的诊断研究——隐孢子虫卵囊染色标本光镜检查

用5种不同染色方法对病牛粪便涂片染色,藉助卵囊和标本背景染成不同的颜色进行形态观察与鉴别诊断。试验结果,抗酸和Giemsa染色方法较好;负染法可作为大量粪样检查时初筛标本使用。     

乳牛流产胎儿中新孢子虫的鉴定

在血清学调查的基础上,进行了流产胎牛体内新孢子虫的鉴定。取新孢子虫血清抗体阳性乳牛的流产胎牛的脑、心、肺、脾、肝等组织进行病理学检查,经HE染色观察到脑组织中存在类似于新孢子虫包囊样结构,经免疫组织化学染色排除刚地弓形虫包囊的存在,确认该包囊为新孢子虫包囊。同时提取流产胎牛脑组织DNA,应用新孢子虫特异性引物Np6/Np21进行PCR扩增,扩增出的特异性目的条带的序列与新孢子虫标准株Nc-1的gene 5序列的一致性为98%。首次证实我国大陆流产胎牛脑组织中存在新孢子虫。     

猴源环孢子虫的分离与分子鉴定

采用饱和蔗糖漂浮法、改良抗酸染色法和孢子化试验首次从广东某猴场的猴粪中分离到疑似环孢子虫卵囊。为了对其进行分子鉴定,采用巢式PCR和普通PCR方法,针对环孢子虫属18SrDNA和ITS基因设计了3对引物,扩增其目的片段,并进行了序列分析。结果显示,卵囊大小为7.5～10μm,经改良抗酸染色的卵囊染色程度不一,孢子化卵囊内含2个孢子囊,每个孢子囊内含有2个子孢子。通过PCR扩增,获得的18SrDNA目的片段长712bp,测序结果表明该猴源环孢子虫18SrDNA基因与Cyclosporacolobi、狒狒环孢子虫、人环孢子虫的相似率较高,在进化树上位于同一分支。获得的ITS-1+片段长760bp,其中ITS-1序列高度特异,在GenBank中未见同源性序列。结果表明,从猴粪中分离的疑似环孢子虫卵囊应属于环孢子虫。     

广东省乳牛隐孢子虫病的流行病学调查

对广东省 10个奶牛场进行了隐孢子虫病的流行病学调查 ,并按大致 10 %的采样率采集了 10 87头乳牛的新鲜粪便 ,以饱和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法检查隐孢子虫卵囊 ,其中检出卵囊的阳性牛 92头 ,阳性率为 8.4 6 % ;有 7个场检出隐孢子虫卵囊 ,场阳性率为 70 %。这 7个奶牛场的卵囊阳性检出率分别是 10 .0 0 %、7.19%、6 .6 7%、9.80 %、6 .72 %、12 .76 %和 6 .72 %。调查发现 ,乳牛隐孢子虫的阳性率和感染强度与乳牛年龄呈负相关关系 ,而且可能与气候有关 ;所检出的隐孢子虫卵囊经形态学鉴定为鼠隐孢子虫 (Cryptosporidiummuris)。     

河南省绵羊隐孢子虫病的流行病学调查

为获得河南省绵羊隐孢子虫的流行病学资料,应用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对河南省4个地区的5个羊场共1701份绵羊粪样进行了检测,并对绵羊隐孢子虫感染的风险因素进行了评估.结果表明,查出隐孢子虫阳性样品80份,总阳性率为4.70%,3周龄羔羊和产后3周母羊的感染率最高,分别为41.18%和6.29%.根据隐孢子虫卵囊的形态学数值分析结果,将发现于绵羊的隐孢子虫卵囊初步鉴定为微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫.同时发现绵羊隐孢子虫感染存在年龄差异,但未见明显的季节性变化.     

牛源犬新孢子虫MAG1基因的克隆及原核表达

为了解牛源犬新孢子虫MAG1基因的免疫学特性,根据MAG1基因序列,设计并合成了1对用于扩增MAG1基因的引物。将PCR扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE结果显示,MAG1在大肠杆菌中获得了较高水平的表达,表达蛋白的分子质量为65ku。Western-blot结果显示,表达的MAG1蛋白可被牛源犬新孢子虫阳性血清特异性识别,表明该MAG1蛋白具有较好的反应原性。本研究为新孢子虫病疫苗及诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

青海省格尔木市乳牛新孢子虫病的血清学调查

用重组蛋白GST-NcSAG1t作为ELISA诊断抗原,对格尔木市乳牛犬新孢子虫病进行了调查。结果,从35份乳牛血清样品中检出犬新孢子虫抗体阳性血清4份,阳性率为11.42%。检测结果说明,青海省格尔木市饲养的乳牛牛群中存在犬新孢子虫感染。     

安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白基因与热休克蛋白70基因的重组联合表达

利用双酶切方法将安氏隐孢子虫热休克蛋白70(HSP70)基因部分编码区连接到含有安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白基因(COWP)的表达质粒pET-32a-COWP上,构建了表达质粒pET-32a-COWP-HSP70。将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,30℃,经1.5mmol/L IPTG诱导表达6h,表达产物主要以可溶的形式表达。使用小鼠抗安氏隐孢子虫超免疫血清为第一抗体进行Western-blot检测,结果有明显的目的条带出现,说明重组蛋白能被抗安氏隐孢子虫抗体识别。     

广西奶牛隐孢子虫病的流行病学调查

为了调查广西奶牛隐孢子虫病的流行情况,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对广西9个奶牛场和4个奶牛个体养殖户的1 612头份粪样进行隐孢子虫卵囊的检测,并以基于18SrRNA基因的PCR-RFLP技术对分离的隐孢子虫卵囊进行种类鉴定。结果显示,7个奶牛场发现存在隐孢子虫感染,隐孢子虫阳性粪样为189头份,总感染率为11.72%(189/1 612)。在感染的年龄段上,1～6月龄犊牛的隐孢子虫感染率为21.3%,显著高于7～12月龄的青年牛(9.6%)和大于1岁龄的成年牛(3.8%)(P<0.01)。感染季节以冬季感染较高,但与夏季感染结果相比差异不显著(P>0.05)。PCR-RFLP分析显示,分离的7个隐孢子虫株均为安氏隐孢子虫。调查表明,广西奶牛隐孢子虫虫株以安氏隐孢子虫为主,感染率与河南、江苏、安徽、吉林等省份相似。     

乳牛衣原体病灭活疫苗的研制

将免疫原性稳定的鹦鹉热衣原体SX5菌株灭活,加入油佐剂制备乳牛衣原体病灭活疫苗,并对疫苗的安全性进行了检测。用该疫苗对成年牛和犊牛进行了最小免疫量试验、效力试验和免疫持续期试验;结果表明,最小免疫量分别为3 mL和5 mL,平均免疫保护率达94．4％,免疫持续期达10个月。疫苗保存期试验表明,在4℃条件下可保存12个月。本动物安全试验和田间小试免疫证明,该疫苗安全性好,乳牛注射疫苗后饮食、产乳量及注苗部位没有明显的异常变化。     

黄牛足螨的形态学观察

采用光学显微镜和扫描电子显微镜对采自四川黄牛的足螨进行了形态学观察和测量。结果表明:各发育阶段的足螨均呈长椭圆形,幼螨大小为(160.9±26)μm×(124.7±17)μm,3对足;雌性若一螨大小为(210.8±29)μm×(160.1±22)μm;雌性若二螨大小为(235.2±18)μm×(183.1±16)μm,体末具有圆柱形突出物1对;雌性成螨大小为(311.4±27)μm×(213.3±21)μm;雄性若螨大小为(216.1±18)μm×(168.2±14)μm;雄性成螨大小为(245.7±24)μm×(191.0±21)μm。其中雄性足螨末端突出物分2节,突出物上竹片状刚毛(Spatulate setae)的长度为168~200μm,最外侧刚毛的平均长度为50μm左右,根据其形态学特征鉴定为德州足螨。     

产后子宫内膜炎病牛子宫内支原体的分离与鉴定

选用产后7～10d的急性脓性子宫内膜炎病牛和健康中国荷斯坦奶牛各20头,通过支原体分离培养、DNA荧光染色法及套式PCR方法,检测了子宫病料中支原体的感染情况,并确定了支原体种类,以探讨支原体感染在奶牛子宫内膜炎中的作用.结果显示,子宫内膜炎病牛子宫的支原体检出率为60%,其中45%发生子宫黏膜细胞感染;而健康组奶牛的...     

耕牛巨盘腹袋吸虫感染情况调查

对贵州省３８个县６３３个乡（镇）的１１２１头耕牛（黄牛３６６头，水牛７５５头）用蠕虫学局部剖检法在其中４５头牛的瘤胃内检出巨盘腹袋吸虫（Ｇａｓｔｒｏｔｈｙｌａｘｍａｇｎａｄｉｓｃｕｓｓｐ．ｎｏｖ．），总感染率为４．０１％，在不同性别的黄牛、水牛无显著差异，而与年龄呈正相关。该吸虫的感染有明显的季节性和地域性，主要分布于潮湿低洼地区。另剖检７６８只山羊和９１只绵羊，均未发现该吸虫感染     

东方蝾螈的形态观察和解剖学研究

采用解剖学方法对8尾东方蝾螈的外形和内脏进行了系统研究。结果表明,东方蝾螈的口裂很宽,口咽腔底壁的前方有不发达的舌。食管短,黏膜上有纵行皱襞;胃呈纺锤形的长囊,肌层发达,贲门口较大;直肠粗大;肝较为发达,有胆囊;胰独立,不与肝混合,但胰管与胆管合并。肺为2个锥形的薄壁长囊,构造简单,囊壁形成蜂窝状。输尿管不直接通膀胱,尿液先到泄殖腔,然后再到膀胱。雄性大鲵无专门的输精管,而是借助于输尿管输精。雌性大鲵有卵巢1对,呈带形的囊状卵巢。     

齐齐哈尔市牛寄生性蠕虫的区系调查

在齐齐哈尔市龙江县、富裕县、泰来县的3个肉牛饲养场随机选取改良成年肉牛52头,用蠕虫学剖检法进行寄生性蠕虫区系调查。结果,在牛体内共检获各类寄生性蠕虫13种,隶属于2门、3纲、10科、12属,其中以捻转血矛线虫、牛仰口线虫、前后盘吸虫、食道口线虫、肝片形吸虫、毛圆线虫和莫尼茨绦虫的感染率和感染强度高,分布广,为齐齐哈尔市牛寄生虫的优势虫种。     

乳牛源隐孢子虫种类的PCR-RFLP和分子种系发育分析鉴定

应用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对从浙江省杭州市整体搬迁至河南省郑州市1个月的某奶牛场隐孢子虫的感染情况进行了调查.共检查624份粪样,隐孢子虫总阳性率为2.24%(14/624).根据其形态结构等特征初步鉴定其为安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni,感染率为2.08%)和牛隐孢子虫(C.boris,感染率为0.16%).对这些分离株进行的小鼠感染试验结果表明,分离的C.andersoni不感染SCID小鼠、正常的及免疫抑制的昆明系小鼠.利用套式PCR成功扩增出12个隐孢子虫分离株的18SrRNA.Ssp Ⅰ和Vsp Ⅰ酶切分析显示,牛源隐孢子虫与骆驼源C.andersoni的酶切图谱相同;系统发育分析结果显示,12个乳牛源隐孢子虫分离株均为C.andersoni.     

乳牛产后期生理性免疫状态的研究

为了研究乳牛在产后期的生理性免疫状态,检测了产后期乳牛淋巴细胞及其亚群数量和淋巴细胞增殖活化功能及其变化。结果发现,乳牛淋巴细胞及其亚群数量和淋巴细胞增殖活化功能在分娩后第1 d最低,然后表现出缓慢上升的总体趋势。CD3细胞数在产后第15 d低于产后第1 d,到产后第30 d时达到最高值;CD4细胞数一直多于CD8细胞数;CD21细胞数在产后第15 d时达到最高值,以后缓慢下降;淋巴细胞的增殖活化能力在产后第30 d最高,未观察到淋巴细胞有明显的凋亡和增生现象。结果表明,乳牛免疫状态在产后第1 d最低,以后逐渐升高,第15 d时细胞免疫最低而体液免疫最高,第30 d时细胞免疫最强。