铜对软骨细胞外基质胶原含量的影响

对仔猪软骨细胞进行了分离、培养 ,并在软骨细胞培养液中添加不同水平的铜 ,以观测铜对软骨细胞外基质胶原含量的影响。结果表明 ,在软骨细胞培养液中添加铜能显著增加细胞培养液中的胶原含量 ,其中以添加 31.2 μmol/L铜的效果最明显。证实铜能促进细胞产生胶原 蛋白     

H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)M基因和HA基因序列设计了3对引物,其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物,另外2对为分别针对AIVH5和H7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物,通过对多重RTPCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别AIVH5、H7亚型的多重RTPCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术对AIVH5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段;对AIVH7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段;对AIVH5和H7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段;对其他AIVHA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段;对其他常见禽病病原扩增均为阴性;该多重RTPCR对AIVRNA、AIVH5和AIVH7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100pg。     

猪IFN-γ mRNA竞争性RT-PCR定量检测方法的建立

无菌分离的猪外周血单个核细胞(PBMC),经ConA体外刺激培养15 h后提取细胞总RNA。以此总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到了435 bp的IFN-γ基因。把扩增到的IFN-γ基因与pMD18-T载体连接,构建了pMD-IFN435重组质粒。用另一对引物对重组质粒pMD-IFN435内部进行PCR扩增,得到了257 bp(含PstⅠ酶切位点)的基因片段,将此基因片段连接到pMD18-T载体上构建了pMD-IFN257重组质粒。将pMD-IFN257双酶切(PstⅠ SalⅠ)后回收的目的片段与pMD-IFN435双酶切(PstⅠ SalⅠ)后回收的目的片段连接,得到了含有367bp目的片段的重组质粒pMD-IFN367,即内标准DNA模板。以定量后的pMD-IFN367与2倍梯度稀释的pMD-IFN435进行竞争PCR扩增,建立了能够准确、方便定量检测猪IFN-γmRNA的标准竞争曲线的线性回归方程(y=0.414x-1.864)。     

高剂量铜对断乳仔猪血液激素和生长因子水平的影响

将 60头断乳“军牧 1号”白猪分成 6组 ,分别饲以添加 0、10 0、15 0、2 0 0、2 5 0和 3 0 0mg/kg铜的基础日粮 ,进行80d的饲养试验 ,以探讨日粮铜水平对仔猪血液激素及生长因子的影响。结果表明 ,基础日粮中添加 10 0～ 3 0 0mg/kg铜能促进仔猪的生长 ,能显著促进循环血液中生长激素 (GH )、胰岛素 (INS)、游离甲状腺素 (FT4)、游离三碘甲腺原氨酸(FT3 )、胰岛素样生长因子 (IGF Ⅰ )及其结合蛋白 (IGFBP3 )的分泌量 ,其中以饲料中添加 2 5 0mg/kg铜水平 ,于试验的第2 0～ 40d最明显 (P <0 .0 1)。     

微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库的构建

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体。经体外包装,成功构建了我国微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库,铺板测定原始库容量为4.5×105PFU,扩增后的滴度为7.2×1010PFU/mL。     

毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

为构建毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA表达文库,用Trizol试剂提取毒害艾美球虫孢子化卵囊总RNA,采用SMART技术,在逆转录酶的作用下将总RNA反转录成第一链cDNA,经LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA).经蛋白酶K消化、Sfi I酶切,过CHROMA SPIN-400TM柱去除小于400 bp的片段,与?TriplEx2TM噬菌体载体连接,用Gigapack ⅢGoldTM载体蛋白包装,构建了cDNA噬菌体表达文库.经测定,原始文库容量为4.72×106pfu/mL,扩增后的文库容量为2.62×1010pfu/mL,重组率为97.5%,插入片段为500～1100 bp.证实,该文库质量良好,为毒害艾美球虫新基因的筛选、克隆及功能研究奠定了基础.     

蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA相对表达水平的实时荧光定量PCR检测

为了检测培养的蒙古绵羊输卵管上皮细胞内sBD-1 mRNA表达水平,运用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术进行了相对定量测定.首先,建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外试验模型,提取细胞总RNA,根据GenBank中羊β-防御素基因序列,设计合成引物,进行实时荧光定量PCR.以β-Actin基因为内参基因,对sBD-1 mRNA进行均一化处理,利用荧光阈值(C2值)计算sBD+1 mRNA的相对表达量.经测序分析,扩增产物为β-防御素.结果显示,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素mRNA表达水平的相对含量.     

猪囊尾蚴cDNA质粒表达文库的构建

从猪囊尾蚴中提取总RNA ,并分离出mRNA ,采用定向克隆方法 ,将猪囊尾蚴cDNA片段重组入质粒表达载体 pSPORT 1的NotⅠ和SalⅠ双酶切位点之间 ,构建了猪囊尾蚴cDNA表达文库。通过库容量鉴定 ,所构建的表达文库的容量为 2× 10 6 ;经含有IPTG和X gal的颜色选择平皿测定 ,其重组率为 10 0 %。     

新兴猪IL-18成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank上登录的猪白细胞介素18(pIL 18)基因序列,设计了1对特异引物。利用RT PCR对从3周龄新兴仔猪脾细胞中提取的总RNA进行了扩增,获得了约500bp的片段。将该片段克隆、鉴定、测序,证实已获得了新兴猪IL 18成熟蛋白基因片段,其大小为474bp,编码157个氨基酸,与GenBank上登录的猪IL 18成熟蛋白基因序列完全一致。     

鸭Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列测定

从植物血凝素 (PHA)刺激的鸭外周血单核细胞提取总RNA ,采用RT PCR扩增鸭Ⅰ型干扰素 (DuIFN Ⅰ)基因 ,将其克隆到pMD 1 8T载体中 ,进行序列测定。克隆到的鸭Ⅰ型干扰素基因与已公布的DuIFN α核苷酸序列同源性为 99.65 % ,氨基酸序列同源性为 98.95 %。同时表明 ,鸭外周血单核细胞在PHA刺激下能够表达Ⅰ型干扰素mRNA。     

鸭肠炎病毒感染鸭肝酵母双杂交cDNA文库的构建

为构建应用于酵母双杂交系统的鸭肠炎病毒(DEV)感染鸭肝cDNA文库,利用Trizol法提取接种DEV GZ株病毒液5 d的鸭肝总RNA,利用cDNA合成试剂盒反转录合成双链cDNA,与pGADT7酵母表达载体连接,转化酵母受体菌Y187,以未经稀释、1∶10和1∶100比例稀释的菌液无菌接种于SD/-Leu缺陷型固体培养基,置于30℃培养3 d,随机挑取生长良好的酵母菌落进行菌落PCR,检测插入片段的大小。结果显示,获得的原始文库克隆总数为1.0×106CFU,随机选取23个克隆进行PCR检测,插入片段长度集中在0.5～1 kb之间。结果表明,构建的cDNA文库有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及表达

从亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒中提取总RNA,采用反转录聚合酶链反应获得了长度约为700bp的核苷酸片段,大小与预期长度相符。扩增产物经克隆测序,证明其为VP1基因。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX 4T 1,成功构建了重组表达质粒pGEX VP1;利用IPTG诱导,表达出了53ku的目的蛋白条带。Western blotting分析表明,表达产物能与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗血清特异性结合。亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP1在大肠埃希氏菌中表达成功。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其免疫活性的初步分析

提取亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒总RNA,用特异性引物通过RTPCR反应获得了约750bp的核酸片段,将其与pGEMTEasy载体连接,并转化大肠埃希氏菌JM109。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序,证明所克隆的片段含有完整的VP1基因;将重组质粒与表达载体pcDNA3.1( )分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接,构建成重组表达质粒,转化宿主菌DH5α,筛选阳性克隆。测序结果证明,目的基因正确插入到表达载体中,命名为pcDNAV;用同样方法将IL18基因插入pcDNAV中,命名为pcDNAVI。用pcDNAVI免疫豚鼠,2周后加强免疫1次,每周用ELISA检测豚鼠血清中的抗体水平。结果表明,pcDNAVI可引发机体产生体液免疫。     

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列表达载体的构建及其转录水平的检测

构建猪肌生成抑制素 (MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体 ,并对mRNA进行转录水平的检测 ,为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后 ,用PCR扩增的 1.2kb目的片段与 pMD18 T载体连接 ,将克隆载体的质粒DNA与同样用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶酶解的表达载体 pET2 8a(+ )质粒定向连接 ,对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录 ,对mRNANorthern杂交进行转录水平的检测。结果 ,所得到的序列与所设计的序列完全一致 ,表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选 ;目的片段定向插入 ,阅读框架正确 ;RT PCR成功地反转录得到约 1.2kb的目的DNA片段 ,Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影 ,见到清晰的 1.2kb特异带     

绵羊生殖道中ghrelin基因的克隆及其表达

从雌性绵羊输卵管、子宫体、子宫颈、阴道组织中提取总RNA,根据已获得的绵羊ghrelin基因eDNA序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出了绵羊ghrelin基因;将扩增产物克隆于pMDl9-T载体后进行测序.以a-肌动蛋白(a-actin)基因作为内参,采用半定量RT-PCR法扩增ghrelin基因,经琼脂糖凝胶电泳后,应用凝胶成像分析系统计算雌性绵羊不同生殖道组织中ghrelin基因的表达量.结果显示,从雌性绵羊生殖道各组织均扩增出了233 bp的ghrelin基因片段;ghrelin基因在子宫体的表达量最高,输卵管内次之,子宫颈和阴道内最低.表明,ghrelin对雌性绵羊生殖系统的调节及生殖激素的分泌等具有重要作用.     

鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡胚IFN-γ基因转录及cDNA克隆的研究

应用反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)技术 ,从鸡新城疫I系疫苗接种的洛阳土种鸡胚脾提取的RNA中扩增到干扰素 γ(IFN γ)基因cDNA。结果表明 ,以 1∶5 0或 1∶10 0稀释度接种后第 4 8h提取的mRNA扩增效果最佳。序列测定显示 ,所克隆的洛阳土种鸡IFN γ基因cDNA与所报道的鸡IFN γ基因cDNA同源性为 99.7% ,相应的氨基酸序列同源性为 10 0 % ,说明鸡IFN γ基因编码区高度保守。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

堆型艾美球虫广东株3-1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的堆型艾美球虫31E基因序列,设计了3条引物,以广东株堆型艾美球虫裂殖子总RNA为模板,利用反转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增获得了31E基因部分片段,将这一片段克隆至pGEMTEasy载体中,经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较,证实了克隆片段的可靠性。序列比较发现,所克隆的基因片段与Eimeriaacervulina美国株(US)、E.acervulinaQH株31EcDNA的核苷酸同源性分别为99.0%和99.2%,推导氨基酸的同源性分别为98.2%和97.6%。     

甲泼尼龙对鸡关节软骨细胞自噬的影响

为探究甲泼尼龙(MP)对关节软骨细胞自噬的影响,机械分离肉鸡膝关节软骨组织,剪碎后,0.25%胰蛋白酶消化30 min,在0.1%的透明质酸酶和0.2%的Ⅱ型胶原酶中消化12 h,于含10%胎牛血清的培养液中进行细胞培养。采用甲苯胺蓝、阿利新蓝染色法和PCR扩增鉴定关节软骨细胞,采用MP和三甲基腺嘌呤(3-MA)处理鸡关节软骨细胞。结果显示,MP促进软骨细胞自噬相关基因的显著表达,并降低细胞活性,3-MA对MP诱导的关节软骨细胞自噬有保护作用。本研究建立了原代肉鸡关节软骨细胞培养方法,初步揭示了MP及3-MA对软骨细胞自噬的作用机理。