雏鹅新型病毒性肠炎病毒对鸭胚成纤维细胞的适应性及增殖特性

为了获得适宜雏鹅新型病毒性肠炎病毒(NGVEV)体外培养的细胞系,开展了NGVEV强毒株在鸭胚成纤维细胞(DEF)适应性和增殖特性的研究。结果表明,NGVEV强毒株经尿囊腔接种10日龄鸭胚传4代,取尿囊液接种DEF,第1代无明显细胞病变;第2代培养至72~96 hDEF出现颗粒状缺失、脱落,但无典型蚀斑出现;第3代培养至96~120 h,DEF形成大小不等、圆形或椭圆形的典型蚀斑;第5代以后的NGVEV可稳定适应于DEF,典型细胞病变出现于48~72h。取适应DEF的NGVEV感染DEF细胞后制作超薄切片经电镜观察,可见典型的腺病毒粒子,大小为70~90 nm。NGVEV在DEF上的TCID50值随着传代次数增加而增高,由第1代的101.23增加到第8代的108.02,最高毒价出现于96~144 h,96~120 h是收获病毒的最佳时间。     

鸡胚成纤维细胞培养鸭瘟病毒的试验

将鸭瘟病毒强毒(DPV34)经12日龄鸭胚连续传2代,收获的尿囊液DPV34F2作为细胞培养的病毒接种于鸡胚成纤维细胞,连续传代5次.结果,从第2代开始,接种DPV的鸡胚成纤维细胞出现细胞病变,随着代次的增加,细胞病变愈加明显.经电镜观察,第5代细胞培养物中有典型的DPV病毒粒子;将第5代培养物接种鸭胚,出现典型鸭瘟病变;用PCR方法检测培养物,也出现DPV的特征DNA带.     

猪链球菌2型SS2-1和SS2-H株的培养稳定性检测

将猪链球菌 2型制苗候选菌株SS2 1和SS2 H在血平板上连续传代至第 41代 ,并分别检测第 1代、第 11代、第2 1代、第 3 1代和第 41代菌株的菌落及细菌形态、生化特性、溶菌酶释放蛋白 (MRP)和胞外因子 (EF)等指标。结果 ,从第1代至第 41代 ,2株细菌的菌落及细菌形态、生化特性、MRP和EF均没有发生变异。这表明SS2 1和SS2 H菌株培养稳定性较好 ,使用限定代次至少可达 41代 ,可作为理想的疫苗生产菌株     

樱桃谷鸭心肌细胞的分离培养与传代研究

为寻找一种经济、可重复的鸭心肌细胞最适培养技术,利用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法分离樱桃谷鸭心肌细胞,并对培养条件和生长特性进行摸索。用台盼蓝染色法检测培养细胞的活性,用HE染色法检测培养细胞的形态,并用抗α-actin蛋白免疫组织化学染色法鉴定培养的心肌细胞。结果表明,通过差速贴壁法分离的心肌细胞在前3代可观察到节律性搏动,α-actin染色阳性,心肌细胞数量较大,活力高,形态呈梭形、星形和多角形。证实,通过酶消化法和差速贴壁法分离到的鸭心肌细胞,可连续传代至12代,细胞纯度及数量能满足心肌细胞研究的需要,为一种可行的鸭心肌细胞培养方法。     

猪肺炎霉形体168弱毒株的回归试验

将猪肺炎霉形体168无细胞培养弱毒株F340经健康小梅山猪连续传5代,每代观察11-16 d,临床无气喘和咳嗽症状,剖检无胰样小叶性肺炎病变,表明该菌株的稳定性和安全性良好;同时采集各传代猪的肺组织,用病肺块组织接种法分离培养猪肺炎霉形体,经72 h培养,其培养液呈微混浊,无沉淀,pH降至6.6,镜检见类圆球形菌体.     

口蹄疫病毒VP1蛋白诱导犊牛甲状腺初代细胞凋亡的鉴定

为了制备和培养犊牛甲状腺初代细胞(CTY),并检测口蹄疫病毒VP1蛋白对其诱导的凋亡情况,采用原代细胞培养方法,取初生犊牛甲状腺制备初代细胞并培养。采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,再用限制性内切酶EcoRⅠ+XhoⅠ酶切后定向克隆到表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-VP1,转染CTY,用Western-blot检测口蹄疫病毒VP1蛋白在犊牛甲状腺初代细胞中的表达情况;通过显微镜观察转染的CTY细胞状态、经AV-PI双染色、检测线粒体膜电位变化和Hoechst-33258荧光染色来检测细胞凋亡。结果显示,成功制备了犊牛甲状腺初代细胞,构建的重组质粒可以在犊牛甲状腺初代细胞中表达,通过几种方法均证明口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导犊牛甲状腺初代细胞的凋亡,细胞凋亡率比空载体对照组高约2倍。结果表明,口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导CTY的凋亡,这一结果为深入研究口蹄疫病毒VP1蛋白凋亡功能域和VP1诱导的凋亡途径奠定了基础。     

鸭肿头出血症病毒在鸭胚原代成纤维细胞中增殖特性的研究

将鸭肿头出血症病毒(DSHDV)强毒株经尿囊腔接种10日龄鸭胚,传3代,取第3代尿囊液接种鸭胚成纤维细胞(DEF),传代培养至有细胞病变出现,并对接毒细胞进行TCID50动态检测和透射电镜观察。结果显示,第1代接毒细胞培养至120 h出现变圆、脱落,并形成少量蚀斑,第2代培养至96~120 h,DEF形成大量圆形或椭圆形的典型蚀斑,第3代培养至72~96 h,DEF出现典型蚀斑;此后可稳定适应于DEF,典型细胞病变出现于72~96 h。DSHDV在DEF上的TCID50值随传代次数的增加而增高,由第1代的102.75增加到第10代的106.82,最高毒价出现于96 h,该点是收获病毒的最佳时间。经透射电镜观察,可见DSHDV粒子呈球形或椭圆形,大小为60~75 nm,无囊膜,具有双层衣壳。结果证实,DSHDV强毒株已经适应了DEF,传代后可获得较高的病毒效价。     

山羊角膜缘干细胞的分离培养

采用分散酶Ⅱ(dispaseⅡ)联合胰蛋白酶二步法分离培养山羊角膜缘干细胞,观察其体外培养特性,通过免疫细胞化学、RT-PCR法鉴定分离培养的细胞。结果显示,获取的细胞形态为多角形,体外培养能传20多代,经免疫组织化学和分子生物学鉴定,细胞表达角膜缘干细胞标志物p63、PCNA、ABCG2和角膜上皮细胞标志物K3/K12和Cx43。本试验建立了山羊角膜缘干细胞的体外培养方法,可为角膜缘干细胞的研究提供方法学基础。     

寄生环形泰勒虫裂殖体的淋巴样细胞遗传稳定性分析

对寄生有环形泰勒虫裂殖体的黑白花牛8301淋巴样细胞株第14、34和90代细胞用乳叶培养液培养后制备标本,观察细胞染色体核型的变化情况.各代细胞染色体数目均为2n=60,常染色体29对,均为端着丝粒染色体,性染色体1对,为亚中着丝粒染色体;各代次细胞染色体均未见嵌合、裂隙及断裂现象,表明该细胞株有稳定的遗传特性.     

O型口蹄疫病毒冷变种的特性

在以前的报告中曾经指出,口蹄疫O型病毒在24℃犊牛肾细胞培养物中继代,可以促进其致弱。在24℃下培养75至90代以后,病毒致弱变种对牛和绵羊有显著的免疫原性。 通过在牛体上,对冷变种的试验证明安全有效(24℃,85～93代)。对免疫动物有0.3％的弱反应,在八个半月的观察期间,其中和抗体保持较高的水中(1:64～1:256)。但是在机体体温过低的情况下(周围环境温度为25～30℃),病毒变种反应性增高,并对未接     

牛肺泡上皮细胞的体外分离培养与鉴定

为阐明口蹄疫病毒在肺部复制的遗传机制,并为口蹄疫发病机制的研究提供细胞模型,对牛肺泡上皮细胞进行了体外分离培养,最终得到纯的牛肺泡上皮细胞。试验采用2.5 g/L胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化法,用局部画圈法逐步去除成纤维细胞,并分离纯化牛肺泡上皮细胞,通过细胞免疫荧光试验、细胞增殖曲线、核型分析鉴定纯化后的牛肺泡上皮细胞。结果表明,采用酶消化法能够成功培养牛肺泡上皮细胞并稳定传至第11代,得到的牛肺泡上皮细胞经广谱角蛋白(Pan-Cytokeratin)鉴定为阳性,染色体核型分析结果显示为正常二倍体(2n=60),显微镜下观察培养的牛肺泡上皮细胞呈现典型上皮样形态,单层细胞呈铺路石状排列;培养至第12代及以后,牛肺泡上皮细胞出现生长停滞、胞体空泡、细胞变大等特点,但仍未从瓶底脱落。试验成功建立了牛肺泡上皮细胞的培养方法,并得到纯的牛肺泡上皮细胞,为后续研究口蹄疫的发病机制奠定了良好的基础。     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙古株的分离与观察

以内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺组织 4例和 3月龄绵羊胎肺 2例作为材料 ,对胎肺细胞进行了原代培养并接种绵羊肺腺瘤病毒悬液 ,进行了绵羊肺腺瘤病毒 (JSRV)的分离 ,同时采用电镜负染色技术和超薄切片透射电镜技术对上述样品进行了观察。结果表明 ,自然感染绵羊肺腺瘤病的 4例病肺组织中都有散在的病毒粒子 ,其直径为 10 0～ 12 5nm ,接种病毒悬液的胎肺细胞从第 2代到第 9代均出现细胞病变 ,但对绵羊胎肺培养的病毒悬液电镜负染色观察未发现典型的病毒粒子 ,而超薄切片透射电镜观察发现了病毒样粒子     

猪链球菌9型GZ0565株体外传代的生物学稳定性

选取猪链球菌9型(SS9)GZ0565株连续传代培养至20代(S1～S20代),用API20Strep生化鉴定试剂条和全自动生化分析仪对各代次之间进行了比较鉴定。生化试验结果表明,GZ0565株传代稳定性好。以特殊品系的黑色小鼠C57BL/6作为SS9感染的动物模型,经腹腔注射接种S1、S5、S10、S15和S20代不同稀释度菌液,统计1周内小鼠的死亡数量。结果显示,攻毒后死亡的小鼠具有典型的细菌性败血症病理变化,肝及脑内可分离到革兰氏阳性球菌,短链状,绵羊血平板上呈β溶血,经PCR检测,从死亡小鼠体内分离的细菌与攻毒菌株为同一种细菌。S1、S5、S10、S15和S20代菌株对小鼠的LD50分别为3.63×108、6.03×108、2.63×109、1.45×109和8.7×1010。证明SS9GZ0565株经过20代传代培养后毒力相对稳定,可作为疫苗候选株。     

山羊成骨细胞的体外培养和鉴定

采用初生山羊羔股骨骨膜,通过植块培养法、完全消化法和半消化植块法分离、培养成骨细胞。结果表明,植块培养法、完全消化法和半消化植块培养法的贴壁时间分别为4、24、4 h;培养4 d时的细胞数量分别为少量细胞、少量细胞、大量细胞,细胞汇合时间分别为21、19、10 d。传代后第7 d即可汇合,第14 d出现矿化结节,茜素红染色呈橘红色,Von Kossa染色呈黑色;姬姆萨和HE染色后可见体外培养的细胞呈三角形、多角形,胞质丰富,胞核卵圆形,单核,有1~3 个核仁;碱性磷酸酶染色后胞质呈黑色颗粒或块状沉淀;扫描电镜观察胞突发达,伸出的突起与临近细胞的突起相连。体外培养传至15代时细胞的生物学性状未发生变化。试验结果显示,半消化植块培养周期短,细胞损害小,有利于细胞贴壁,是一种可行的骨组织工程研究方法。     

转型期俄罗斯高等师范教育改革及引发的思考

当前,俄罗斯高等师范教育面临着高等教育全球化、市场经济冲击、师范教育终身化、师资需求多样化发展的压力与挑战。俄罗斯政府通过制定并批准的第三代《联邦国家高等职业教育标准》提出重视教师培养质量、造就个性化新型教师等措施对师范教育的改革战略进行调整。研究俄联邦高等师范教育改革,可为我国高等师范教育改革提供借鉴。     

法国猪伪狂犬病弱毒疫苗Alfort26株简介

法国猪伪狂犬病自1970年以来日趋严重,给国民经济造成很大损失,已引起有关部门的重视。法国兽医学者托马等,通过低温在细胞上系列传代,培育出Alfort_(26)弱毒疫苗株,已用于生产实际。 (一)Alfort(26)弱毒株的培育 作者用从患猪伪狂犬病的病猪体分离的Alfort(27)强毒株,在猪肾的PK_(15)、R·P·《D》、R·P·《T·G·》三个细胞系上低温传代而致弱的。在第一代,于含有2％氨基酸的MEM培养液中添加5％的犊牛血清。第二代培养于含有10％的犊牛血清的MEM培养液中。在传代中培养     

牛附红细胞体体外培养试验

用RPMI 164 0、M 199、D MEM 3种培养液作为基础培养基 ,再分别按体积分数加入 40 %的犊牛血清 ,采用普通恒温培养箱 (3 7℃ )进行牛附红细胞体体外培养。结果表明 ,牛附红细胞体在RPMI 164 0培养基中 ,每 12h更换 1次培养液 ,并补充适量正常红细胞 ,获得了高达 99%的感染率 ;连续传代培养可达 44代以上。     

猪气喘病弱毒菌株免疫研究

自1974年,用甘肃省兰州市安宁区强毒菌株人工感染传二花脸168号猪发病,从该病猪肺中分离到猪肺炎霉形体168号菌株。与国际参考菌株J株高兔兔血清作微粒凝集试验、生长抑制试验和代谢抑制试验都证实为猪肺炎霉形体。经14年连续继代300多代次,作数十次回归健康猪测试毒力。约在300代后对健猪的毒力已明显下降。试作免疫注射测其安全性和免疫力。结果:304代对杂交2代猪巳趋安全,340代对杂交1代猪也趋安全。经强毒攻击免疫平均保护率(攻毒后透视无阴影,无症状)为84.04％,60天康复率为95.35％。但对纯繁二花脸猪尚不安全。曾以健康杂交猪与340代免疫猪混圈饲养60天,经X线透视未见肺脏病变。间接血球凝集反应检查血清为阴性。屠宰后采集肺脏接种培养无猪肺炎霉形体出现。免疫接种弱毒菌苗猪的生长、增重与健猪比较,无明显差异。免疫期已测到6个月。现已在野外病猪场作少量试用。     

细胞悬液的冷藏方法试验

在生产中 ,传代细胞的培养常常会遇到复活的细胞种还没有繁殖起来而种细胞急需更换 ,从而或多或少地影响产量和生产进度。为了解决这一问题 ,笔者在生产中经过多次试验和摸索 ,发现交替冷藏细胞悬液可以保证细胞稳定培养 ,满足生产需求。方法是 :在传代细胞的培养中 ,挑选一瓶生长良好、形态正常、排列整齐、无污染的种子细胞 ,在无菌条件下消化 ,用 4 0 0～ 5 0 0ｍＬ细胞培养液制成细胞悬液 ,然后由 15 0 0 0ｍＬ大转瓶移入 5 0 0ｍＬ磅瓶内 ,封好瓶口 ,贴上标签 ,注明细胞代次和日期 ,放入4℃冰箱冷藏备用。当需要时从冰箱取出 ,沿同一方…     

带毒传代工艺在狂犬病细胞苗生产中的应用

狂犬病细胞苗的传统生产方法是取长成“ ”的BHK21 细胞单层,弃去生长液(血清含量 100mL/L),按1.5万mL细胞培养瓶每瓶 40 mL的量接毒旋转,使毒液浸润整个细胞面,37 ℃旋转吸附40~ 60 min,加入 2 000 mL 维持液(含血清 30mL/L),37℃旋转培养48 h后,调pH至7.2~7.4,继续培养至96~120 h,冻毒,收获细胞培养物。传统方法的生产成本高,劳动强度大,种毒使用量大。2004年笔者采用带毒传代工艺生产狂犬病细胞苗,效果较为满意。　　材料　毒种为中国兽医药品监察所提供的狂犬病病毒ERA 株适应株第 1 代毒,经本厂传至第 4代,经检验符合生产…