猪和兔附红细胞体的体外培养

用RPMI1640和小牛血清按不同比例混合作为体外培养猪和兔附红细胞体的基础培养基,同时以去掉红细胞上自然感染的附红细胞体后的红细胞泥作为培养附红细胞体的寄生载体,进行猪和兔附红细胞体的体外培养。培养结果表明,以 RPMI1640 与小牛血清按 6∶4 比例混合,同时选用兔红细胞泥作为载体的培养效果最佳,接种感染了附红细胞体的猪、兔阳性红细胞后 24 h生长达到高峰,感染率分别为40.2%和31.0%,而采用猪红细胞泥作为培养载体时红细胞感染率无明显升高。     

附红细胞体感染对猪红细胞免疫功能的影响

对急性附红细胞体病猪的红细胞免疫功能进行了检测。结果显示,感染附红细胞体病猪的RBC CR1花环率显著下降,RBC IC花环率变化不明显。表明附红细胞体侵袭红细胞的同时,破坏了红细胞膜表面的C3b受体,红细胞膜表面游离状态的C3b受体数量明显减少,导致机体红细胞的免疫黏附活性降低,红细胞免疫功能低下。     

猪附红细胞体PPA-ELISA检测方法的建立

用物理方法纯化猪附红细胞体抗原,用纯化抗原免疫兔制备超免疫血清,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗,建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA ELISA)检测方法。结果显示,用PPA ELISA方法检测猪血液中的附红细胞体,具有很高的敏感性和特异性,重复性良好,完全适用于猪附红细胞体病的实验室诊断。     

猪附红细胞体PCR-ELISA检测方法的建立

根据猪附红细胞体OxaA膜蛋白基因设计了1对分别标记生物素和地高辛的引物,将PCR扩增产物固定至链霉亲和素包被的酶标板中进行酶联显色检测,并优化PCR扩增及ELISA检测步骤,建立了猪附红细胞体PCR-ELISA。结果显示,该方法较传统的PCR-ELISA节约近2h,最低能检出0.36pg的猪附红细胞体DNA,敏感性比常规PCR高10倍,且与猪链球菌、猪肺炎霉形体、大肠杆菌等无交叉反应。用该方法对64份猪血液中提取的DNA样品进行检测,结果阳性检出率为35.9%,明显高于常规PCR的28.1%。结果表明,建立的猪附红细胞体PCR-ELISA具有敏感、特异、安全和快速的特点。     

猪附红细胞体DnaJ基因的克隆及真核表达

为研究猪附红细胞体DnaJ基因的功能,根据GenBank中的猪附红细胞体全基因组序列（NC₀15153.1）,应用DNAStar、DNAMAN和ExPASy网络服务器筛选出1个候选蛋白基因DnaJ,设计合成1对特异性引物,经PCR技术扩增出DnaJ基因片段,克隆至pMD18-T载体上,并亚克隆到真核表达载体pVAX1上,构建了重组真核表达质粒pVAX-DnaJ,脂质体介导转染Vero细胞进行真核表达,RT-PCR和IFAT检测DnaJ基因在Vero细胞中的表达。结果表明,PCR扩增DnaJ基因的片段长度为876bp,编码292个氨基酸,与GenBank中的DnaJ基因同源性为99%;DnaJ基因在Vero细胞中获得瞬时表达。本试验为猪附红细胞体DnaJ基因的生物学特性及核酸疫苗的研究奠定了基础。     

猪和兔附红细胞体的形态学及生殖方式观察

应用光镜和电镜对猪和兔附红细胞体的显微和超微结构进行了观察。结果表明,猪和兔附红细胞体在光镜和电镜下的形态结构、大小以及在红细胞上的附着方式等均无显著差别,其形态多为球形、卵圆形,直径0.2～2.5μm,在红细胞表面以一根或数根纤丝连接成串珠状或单个寄生。在透射电镜下,首次观察到附红细胞体边缘有一段20～30nm厚的光亮区域,并且在扫描和透射电镜下同时观察到附红细胞体的出芽生殖现象。由此推测,附红细胞体的发育方式为成熟的附红细胞体以出芽的方式产生1个未成熟形态的附红细胞体,随着未成熟形态附红细胞体的发育,逐渐从成熟附红细胞体体内脱离出来,最后以纤丝与成熟附红细胞体相连接;脱离出来的未成熟形态的附红细胞体黏附到同一红细胞或临近红细胞的膜上,最终发育成1个成熟的附红细胞体。     

猪附红细胞体a1基因的克隆及序列分析

为研究猪附红细胞体DnaK样蛋白HspA1编码基因a1的遗传变异规律,根据GenBank上登录的猪附红细胞体a1基因核苷酸序列(登录号AM265536)设计合成1对引物,从上海市3个屠宰场采集自然感染猪附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA作为模板,进行a1基因部分序列的PCR扩增、克隆、序列测定及生物信息学分析。结果显示,共获得了41条猪附红细胞体a1基因片段序列,序列长度均为1 657bp;同源性分析显示,它们与GenBank中登录的猪附红细胞体a1基因核苷酸序列的相似性在97.7%~99.9%之间,氨基酸序列的相似性在99.1%~99.8%之间。系统进化分析表明,多数上海市猪附红细胞体分离株的a1基因与GenBank中登录的德国54/96分离株a1基因序列在同一个聚簇上。     

猪犬人附红细胞体对小白鼠的感染试验

选健康小白鼠 30只 (其中 3只为怀孕母鼠 ) ,随机分为 9组。A1、A2 、A3 组分别于荐臀部皮下注射患附红细胞体病猪、犬、人的全血 ;用感染附红细胞体小白鼠的全血分别接种B1、B2 、B3组 ,其余 3组分别混笼饲养 ,并在饲料中添加患附红细胞体病猪的全血 ,在被感染附红细胞体小白鼠污染的垫料环境中饲养。结果 ,猪、犬、人附红细胞体均可以感染小白鼠 ;被感染的小白鼠也可以再感染同种动物 ;母鼠可垂直感染 (传播 )胎儿。表明荐臀部皮下注射是直接的传播途径 ,接触和食入病原也可以传播     

小附红细胞体mpg1基因的克隆及序列分析

根据猪附红细胞体3-磷酸甘油醛脱氢酶样蛋白1基因(msg1)序列设计引物,对上海地区分离的小附红细胞体阳性猪全血DNA进行PCR扩增,获得小附红细胞体3-磷酸甘油醛脱氢酶样蛋白1基因(mpg1)并进行测序和分析,研究其遗传变异特点。结果显示,共获得了11条小附红细胞体mpg1基因序列,序列长度均为1 011bp。同源性分析显示,所获得的11条小附红细胞体mpg1基因序列之间的相似性为96.8%~99.9%,预测氨基酸序列的相似性在97.9%~100%之间;与GenBank中公布的猪附红细胞体msg1基因核苷酸序列相似性在96.6%~98.2%之间,氨基酸序列的相似性为98.2%~99.1%。系统进化分析表明,msg1基因与mpg1基因共同构成每个聚簇。     

猪附红细胞体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能定性与定量检测猪附红细胞体的方法,根据GenBank中猪附红细胞体的16SrRNA基因高度保守区设计了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了一种快速检测猪附红细胞体核酸载量的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法在107～101 copies/μL具有良好的线性关系(RSq=0.999)。能检测到模板的下限为30copies,灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。该检测方法与其他猪常见病病原体无交叉反应,具有良好的重复性。对临诊疑似猪附红细胞体感染猪血液进行了检测,其检出率比常规PCR方法高10%。表明该方法可用于临床上猪附红细胞体的检测及定量分析。     

宁夏猪附红细胞体病的流行病学调查及治疗试验

对宁夏区猪附红细胞体病进行了流行病学调查。调查结果显示,发病区和非发病区(黄河灌区、中部干旱区、南部山区)的3个不同气候类型区猪附红细胞体感染率的不同与吸血昆虫的种类和数量有关。发病区、黄河灌区、中部干旱区和南部山区(六盘山阴湿地区)猪的感染率分别为100%、71．67%、36．67%和51．57%。发病区与非发病区差异极显著(P＜0．01)；发病区、黄河灌区在昆虫活动季节与昆虫越冬季节的猪附红细胞体感染率差异显著(P＜0．05)；中部干旱区、南部山区昆虫活动季节与昆虫越冬季节的差异不显著(P＞0．05)。体外药敏试验和临床治疗试验证明,庆大霉素、长效土霉素、强力霉素、地霉素、贝尼儿、青蒿素、磷酸伯胺喹啉对猪附红细胞体病皆有效,尤以磷酸伯胺喹啉、青蒿素和强力霉素疗效显著。     

禽呼肠孤病毒鸡源分离株的鉴定与人工感染试验

从临床患病鸡关节病料中分离到一株病毒,在电镜下观察到病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,外衣壳直径约75 nm,内核约50 nm;分离病毒株对酸、热有较强的抵抗力,对乙醚不敏感;病毒感染鸡胚成纤维细胞上能产生以融合细胞为特征的CPE;爪垫接种1日龄雏鸡表现出明显的病毒性关节炎临床症状,并伴有吸收障碍型和坏死型的病理变化;血清中和交叉试验表明,该病毒分离株与国内的2株番鸭源呼肠孤病毒(YH和YB)分离株和国外S1133呈不同程度的交叉反应。通过对分离病毒株进行电镜观察、理化特性试验、病毒感染力测定、致病性试验、血清学试验,可以确定该分离病毒为禽呼肠孤病毒。     

猪附红细胞体实验动物模型的建立

为建立一种合适的猪附红细胞体病动物模型,利用摘除脾和/或注射地塞米松的昆明小白鼠,以腹腔注射方式人工感染猪附红细胞体,通过血液涂片镜检、PCR检测、临床症状观察及病理剖检对感染情况进行了鉴定。结果显示,猪附红细胞体能够经腹腔注射感染昆明小白鼠,且感染鼠表现出与猪附红细胞体病相似的临床症状。结果表明,猪附红细胞体实验动物模型已成功建立,并证实啮齿类动物在附红细胞体的传播过程中发挥着重要作用。     

猪鼻支原体的分离鉴定及其对巴马猪的致病性试验

为了探索猪鼻支原体(Mhr)对仔猪的致病性,从临床呼吸道疾病的患猪肺分离到1株猪鼻支原体流行菌株(Mhr-DL株)。对该菌株16SrRNA序列进行的分析证实,它与GenBank中的猪鼻支原体(AB680688)、猪肺炎支原体(NR_074745)和猪滑液支原体(KC512403)的同源性分别为99.3%、92.8%和74.0%。电镜下该菌为多形性,大小为500~600nm。取Mhr-DL菌株培养物(1.8×109 CCU/mL)经腹腔和气管途径接种SPF小型巴马猪,被感染猪临床上表现为精神沉郁、粪便干燥、食欲不振、结膜炎、体温高达41.6℃;剖检时病理表现为肺、肝、脾等器官纤维渗出,淋巴结充血肿胀、胸膜炎、腹膜炎、肺呈虾肉样病变。菌株核酸检测发现,肺和扁桃体检出率最高;组织病理表现为间质性肺炎,淋巴细胞增生、坏死、崩解,肾毛细血管淤血,小肠固有层大量嗜酸性粒细胞浸润、肠绒毛结构不完整,心脏小血管淤血,脾白髓内淋巴细胞增生。本研究获得的Mhr-DL菌株对巴马猪具有显著的致病性,为今后深入开展猪鼻支原体致病机理和防控技术的研究奠定了基础。     

山西省猪附红细胞体病的流行病学调查

从山西省晋中、太原、大同、阳泉、晋城、临汾、运城、朔州和忻州市及吕梁地区的规模化猪场和散养的种公猪、种母猪、肥猪、生长肥育猪、断奶仔猪、哺乳仔猪采静脉血 170 2份 ,进行压片镜检 ,均检出附红细胞体 ,感染率达 10 0 %。对 5 0头产仔母猪于产后第 2d同时采母猪及其 3头仔猪血样检查 ,母猪及其仔猪均为阳性。表明了垂直传播可能是目前猪附红细胞体感染率高的原因之一。     

猪源新城疫病毒的分离鉴定

从发生呼吸道症状的病猪鼻腔中分离到 1株病毒 ,经电镜观察、血凝和血凝抑制试验 ,确定为新城疫病毒。经对鸡胚平均致死时间、鸡胚半数致死量、对鸭胚和鸡、鸭的致死性测定及荧光PCR检测 ,证明分离毒为温和型毒株。     

猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16 S rRNA基因序列设计了1对引物,分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体,确定特异性产物的Tm值,同时做普通PCR。试验结果表明,特异性产物的Tm值为88.5℃,最低能检测到含0.036 fg/μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR,通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化,建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性,为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

通过实验室检验 ,从福建省 2个送检猪场猪的肝、脾病料中分离出 2株猪胸膜肺炎放线杆菌 ,结合临床表现 ,推断它们均具有较强的致病性     

浙江省副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

从浙江省5个县(区、市)疑似患有多发性浆膜炎和关节炎猪的98份病料中分离到26株细菌,通过细菌形态、培养特性和生化特性观察以及PCR鉴定最终确定为副猪嗜血杆菌。对26株已确定为副猪嗜血杆菌的分离株进行了血清学分型和药敏试验。结果显示,分离到的26株副猪嗜血杆菌分离株中,4型8株,5型6株,12型5株,13型2株,其余5株无法分型,并且副猪嗜血杆菌对头孢类药物、氟喹诺酮类药物及庆大霉素敏感,对复方磺胺类药物、大环内酯类抗生素及氯霉素敏感性略有不同,对四环素、氨苄青霉素具有耐药性。试验结果对浙江省猪场副猪嗜血杆菌病的防治提供了指导依据。     

猪源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定

从福建省某猪场疑似猪瘟的发病仔猪采集病料,处理后接种于牛肾细胞(MDBK),分离到1株病毒,并对其进行了系统鉴定.结果显示,病料接种MDBK细胞72 h后产生了明显的细胞病变;该分离毒株可以被牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性血清中和,中和效价为1:106;该分离毒株对氯仿、乙醚、胰酶、酸敏感,不耐热,56℃30 min...