禽流感病毒M1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立

以禽流感病毒(AIV)重组M1蛋白作为检测抗原,兔抗M1血清为阻断抗体.建立了检测AIVM1抗体的间接阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原最佳包被浓度为0.78 μg/mL,阻断抗体最佳稀释度为1:15 000,待检血清最佳稀释度为1:10.用该ELISA方法对38份AIV阳性禽类样本和26份A1V阴性禽类样本进行检测,结果显示.该方法的敏感性为97.37%,特异性为96.15%.交叉试验证明该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应.用该ELISA方法对268份已知HI效价的临床样品进行检测,结果与HI的符合率达92%以上.表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于AIV抗体的检测和禽流感的流行病学调查.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒(AIV)A/Goose/HLJ/p46/2003(H5N1)的NS1基因,将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上,转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析,表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示,重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后,经0.3mmol/L的IPTG诱导,融合蛋白MBP-NS1得到大量表达,融合蛋白以可溶形式存在,分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明,融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应,而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法,为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种能快速、特异、敏感地检测血清中小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的方法,通过RT-PCR方法扩增出1 830bp的小反刍兽疫病毒的H基因,并将其克隆至原核表达载体pET-22b(+)中,进行H基因的重组表达。采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。通过矩阵法优化抗原最佳包被浓度、血清稀释度、最佳封闭剂、酶标二抗的最佳稀释度及孵育时间。结果显示,重组H蛋白(分子质量为68ku)能与PPRV阳性血清发生特异性反应。用建立的间接ELISA与标准竞争ELISA试剂盒检测92份临床样品并进行比较,两者的符合率为94.11%。结果表明,本研究建立的间接ELISA可以用于临床PPRV抗体的检测。     

牛布氏杆菌间接ELISA检测方法的建立

采用原核表达并纯化的布氏杆菌周质蛋白BP26作为包被抗原,建立了检测牛布氏杆菌血清抗体的间接ELISA(iELISA)方法。用建立的iELISA方法对138份临床奶牛血清样本进行了检测,并与虎红平板凝集试验(RBPT)和套式PCR(nested-PCR)进行了比较。结果表明,所建立的iELISA与RBPT和nes-ted-PCR的符合率分别为97.82%和98.55%。尽管该方法的敏感性略低于nested-PCR,但用iELISA检测病牛血清的阳性率可达93.00%。该iELISA方法可作为一种有效的牛布氏杆菌病血清学诊断的备用方法。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

采用超声裂解的副猪嗜血杆菌菌体上清作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法.通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度80μg/mL;37℃作用2 h后4℃过夜包被,待检血清的稀释度为1:320,抗原抗体反应时间为1 h,酶标二抗稀释度为1:15 000,作用时间为1 h,底物显色时间为15 min.待检血清S/N值≥2.5时判为阳性,S/N值<2.5时判为阴性.特异性、重复性和敏感性试验以及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法的特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查.     

小反刍兽疫病毒N蛋白主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为了建立可特异性地检测血清中抗小反刍兽疫病毒(PRRV)抗体的方法,对具有小反刍兽疫病毒特异性的N蛋白第Ⅳ区域进行扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,用于小反刍兽疫病毒N亚单位重组蛋白的表达。用纯化的重组蛋白作为检测抗原,建立了检测血清中抗小反刍兽疫病毒抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA的抗原包被量、血清稀释倍数、血清孵育时间等反应条件进行了优化。Western-blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的反应原性。所建立的间接ELISA方法可以鉴别血清中的小反刍兽疫病毒抗体和牛瘟病毒抗体,具有良好的特异性和灵敏性,与标准竞争ELISA试剂盒的符合率达98.4%。证实,本研究建立的检测血清中抗PPRV抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性和灵敏性。     

水貂肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以抗水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)单克隆抗体为捕获抗体、兔抗MEV多克隆抗体为检测抗体,建立了MEV双抗体夹心ELISA检测方法。该方法用于MEV抗原的检测。经过试验,单克隆抗体的最适稀释度为1∶20,兔抗MEV多克隆抗体的最适稀释度为1∶3 200。用该ELISA方法分别检测MEV、水貂阿留申病病毒、犬瘟热病毒样品。结果表明,ELISA方法具有良好的特异性。用该ELISA和PCR同时检测158份临床样品,其中ELISA检测40份为阳性,PCR检测44份为阳性,该ELISA的特异性和敏感性分别为95.6%和79.5%,这2种方法的符合率为91.1%。该方法的建立为MEV的检测及水貂病毒性肠炎的流行病学调查提供了工具。     

产肠毒素大肠杆菌F41菌毛抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的重组F41茸毛蛋白作为检测抗原,建立了检测产肠毒素大肠杆菌F41菌毛抗体的间接ELISA方法.经优化筛选的最佳反应条件:包被抗原浓度为0.26μg/孔,血清稀释度为1:800.酶标二抗工作浓度为1:6 000,30 g/L明胶封闭1 h,底物作用时间为10 min.经试验验证,该方法具有特异性好、敏感性高、重复性好、稳定性强等特点.用建立的间接ELISA方法与PCR方法进行符合性试验,总符合率为97.4%.表明,该方法可以用于产肠毒素大肠杆菌F41菌毛抗体的检测.     

奶牛流产衣原体OmpA抗原间接ELISA检测方法的建立

以奶牛流产衣原体外膜蛋白A(OmpA)作为抗原,筛选最佳反应条件,建立了奶牛衣原体病间接ELISA检测方法。结果显示,OmpA的最佳包被浓度为1∶320;血清最佳稀释度为1∶40;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;抗原的最适包被条件为37℃1h加4℃过夜;ELISA的阴性、阳性临界值为0.391。用本方法和衣原体间接血凝试验检测奶牛血清田间样品206份,两者的符合率为95.3%。本试验建立的OmpA-ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,可为牛衣原体病的诊断及流行病学调查提供有效工具。     

犬和猫狂犬病病毒抗体SPA-ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法扩增狂犬病病毒(RV)FluryLEP毒株N基因,将该片段克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,测序验证后将阳性重组质粒转化至宿主菌E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,RVN蛋白以包涵体形式表达,大小约为70ku,且该重组N蛋白具有良好的反应原性。用纯化的重组N蛋白作为诊断抗原建立了检测犬、猫RV抗体的间接ELISA方法,通过优化反应条件,确定抗原的最佳包被浓度为6μg/mL,血清最佳稀释度为1:200,SPA-HRP的最佳稀释度为1:2000。用该间接ELISA方法与以狂犬病病毒作为诊断抗原的商品化ELISA试剂盒分别对30份临床血清样品进行检测,结果两者的符合率为96.67%。表明基于重组N蛋白的间接ELISA方法可用于检测犬、猫RV抗体水平。     

A型禽流感病毒NS1蛋白的表达及其诱导细胞凋亡功能的研究

利用瞬时表达方法表达禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,并初步研究了体外表达的NS1蛋白对宿主细胞凋亡的影响.应用脂质体介导法,将含有不同亚型AIV NS1基因的阳性质粒pcDNA3.1(+)-qNS1(H5N1)、pcDNA3.1(+)-rNS1(H9N2)转染Vero细胞系及MDCK细胞系.经SDS-PAGE及Western-blotting检测,qNS1和rNS1基因在Vero细胞及MDCK细胞中均获得了表达.应用AO/EB荧光染色法、Annexin V-PI法分别对转染后的Vero细胞及MDCK细胞进行细胞凋亡检测,结果显示,转染阳性质粒的MDCK细胞凋亡率增高,而转染空载体pcDNA3.1(+)的MDCK细胞及转染的Vero细胞均无明显变化.表明,qNS1、rNS1蛋白在体外培养的MDCK细胞中表达并能够诱导其发生凋亡,而在Vero细胞中却不能发挥此功能.     

猪肺炎霉形体膜蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

通过提取猪肺炎霉形体ATCC25095株膜蛋白,并用免疫亲和层析柱对膜蛋白进行纯化,经SDS-PAGE分析得到了分子质量分别为66、50、46、42、32和24 ku的6种膜蛋白。以纯化的膜蛋白为包被抗原,建立了检测猪肺炎霉形体抗体的间接ELISA检测方法。结果显示,纯化的抗原具有更好的重复性和敏感性,对临床检测样品的检出率高于IDX ELISA试剂盒。     

猪瘟病毒中和抗体竞争抑制ELISA检测方法的建立

利用杆状病毒表达的猪瘟病毒(CSFV)重组E2蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的E2蛋白中和性单克隆抗体作为竞争抗体,建立了一种用于检测CSFV中和抗体的重组E2蛋白竞争抑制ELISA(CI-ELISA)方法。经筛选确定,CI-ELISA的抗原最佳包被浓度为3μg/mL,酶标竞争抗体的最佳稀释度为1∶4 000,阴性血清临界值为33%,阳性血清临界值为40%。CI-ELISA的检出下限为1∶44(中和抗体效价),与进口阻断ELISA试剂盒的符合率为85.00%,高于间接ELISA与进口阻断ELISA试剂盒的符合率(81.25%),CI-ELISA与其他主要病毒的阳性血清均无交叉反应。对采自我国4个省份的290份现地血清进行CI-ELISA检测,结果273份(94.1%)为CSFV抗体阳性。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达

利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析。结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B。再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1。经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21(DE3)(pLysS)感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白。用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性。     

鹿流行性出血病病毒VP7-ELISA抗体

以原核表达的鹿流行性出血病病毒(epizootic hemorrhagic disease virus of deer,EHDV)VP7蛋白为包被抗原,用HRP标记的兔抗羊IgG作为二抗,建立了检测EHDV群特异性抗体的间接ELISA方法(VP7-ELISA).用VP7-ELISA方法检测EHDV阳性血清、其他病毒阳性血清及健康羊血清,结果表明,VP7-ELISA方法具有良好的特异性;用VP7-ELISA和琼脂扩散试验(AGID)检测EHDV阳性血清抗体效价,结果表明,VP7-ELISA的敏感性相当于AGID的8～16倍.用VP7-ELISA和AGID同时检测临床样品188份,VP7-ELISA的特异性和敏感性分别为95.9%和100%,两种方法的符合率为96.3%.表明VP7-ELISA可以代替AGID用于EHDV抗体检测.     

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中登录的H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)血凝素基因序列,设计了1套特异识别HA基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立了一种基于LAMP技术的H5亚型禽流感病毒诊断方法。结果表明,该方法对H5-AIV RNA的最小检测限为10-6,灵敏性高于一步RT-PCR方法;全部反应可在1.5 h内完成;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。灵敏性及特异性试验证明,该方法灵敏度高、特异性好,能够作为H5亚型禽流感病毒的快速诊断方法。     

口疮病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立检测口疮病毒(orf virus,ORFV)抗体的间接ELISA方法,原核表达口疮病毒B2L蛋白与6×组氨酸标签的重组蛋白;对纯化复性后的重组B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的重组B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测ORFV抗体的间接ELISA,并进行特异性、灵敏度和重复性评价,最后应用所建立的间接ELISA对来自四川部分地区的384份山羊血清样品进行检测。结果显示,成功原核表达出42 ku的重组ORFV B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的抗原反应性。间接ELISA最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为5μg/m L,1∶100稀释血清作用2 h,酶标二抗以1∶2000稀释作用30 min,TMB显色时间为15 min。在该优化条件下,D450≥0.31为阳性。该方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性。临床样品的间接ELISA检测结果显示,总阳性率为66.67%(256/384),其中未接种过疫苗的羊只抗体阳性率为34.81%(55/158)。上述结果表明,建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测,四川部分地区山羊场羊只感染野毒的概率较大,疫苗免疫效果不佳。