反义核酸技术及其在寄生虫学研究中的应用

反义核酸技术及其在寄生虫学研究中的应用陈启军，李德昌（解放军农牧大学长春１３００６２）反义核酸是指一段与基因组ＤＮＡ或ＲＮＡ互补的ＤＮＡ或ＲＮＡ。它包括三个方面的内容，即反义ＤＮＡ、反义ＲＮＡ和核酶。反义核酸技术（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｎｕｃｌｅ－ｉｃａ...     

核酸探针制备方法简介

随着分子生物学的飞速发展,利用核苷酸碱基配对原理建立的核酸杂交技术已广泛地应用于分子生物学、医学和兽医学的各个领域。核酸杂交技术的应用使疾病诊断由检测体内正常、异常成份变化的理化诊断方法和检测抗原-抗体反应的免疫学诊断方法发展到了基因诊断水平,从而使疾病的诊断更为准确、可靠。核酸杂交技术中,常用放射性同位素(~(32)P、~3H、~(35)S、~(14)C)或其它标记物(半抗原、酶、生物素)标记特异核苷酸片段来制备核酸探针。现将常用核酸探针制备的方法作如下简介。     

核酸杂交诊断检测技术概况

近年来,随着分子生物学研究的不断深入,利用重组DNA技术建立的核酸杂交诊断检测技术已经开始在病毒细菌的快速诊断,病毒分子流行病学调查,病毒核酸定量、细胞内病毒感染及整合病毒序列测定等方面应用,使某些疾病的诊断检测水平走向一个新层次。核酸杂交技术具有敏感性高,特异性强,简便快速等优点。它不仅可以检测游离的病原核酸,还可以分析整合于细胞DNA上的病毒核酸序列。有些疾病只有检测     

核酸未来的疫苗

核酸未来的疫苗靳家声（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）核酸将会成为第三代疫苗而被使用。第一代和第二代疫苗是根据获得抗原材料的两种技术来划分的。第一代疫苗采用的技术是获得活的致弱的生物体，或者杀死的整个生物体；第二代疫苗采用了另一种技术，通过...     

核酸探针技术研究进展

为有效地控制和治疗疾 病,当前极需研究快速、可 靠、高度特异的诊断技术。因 通常使用的免疫学试验方法往往满足不了这些要求,不能可靠地区分两个紧密相关的种(或株);不能真实地说明动物当时的健康状况。随着科学技术和工业生产的发展,在今后的日子里,核酸探针、限制酶分析(REA),聚合酶链反该(PCR),单克隆抗体和ELISA等分子生物学诊断技术将会很快地走出科学家的实验室,成为广大的野外兽医和实验室工作人员诊断疾病的有力武器。在分子生物学技术里核酸探针技术是最有实用前景的     

生物素标记核酸探针的应用概况

目前,基因探针已用于人和家畜传染病、寄生虫病的诊断及流行病学的调查。它具有高度的敏感性,并且基因探针的检测是建立在探针和待检基因序列同源性的基础上,因此具有高度的特异性。基因探针采用的标记方法有同位素标记、生物素标记和化学修饰核酸标记。但在这之前,用得较多的仍然是同位素标记的核酸探针。然而,由于放射性同位素的应用存在着不够安全方便、实验周期长、半衰期短、价格昂贵以及污染等缺点,使分子杂交技术的推广应用受到一定程度的局限。为此,各国研究工作者一直在探讨一种非放射性的核酸标记方法。近年出现的生物素标记的核酸探针技术就是这方面的一大突破,此种生物素化的脱氧尿嘧啶苷,     

蓝舌病毒核酸杂交技术的研究

核酸杂交技术的出现为蓝舌病(BT)的诊断开拓了一个新纪元,它是检测蓝舌病毒(BTV)既快速又敏感的方法。本技术不依赖于病毒分离与鉴定,而是直接检测蓝舌病毒的基因片段,具有很高的特异性。我们应用〔γ~(-32)p〕ATP末端标记BTV全基因组,进行打点杂交和Northern印渍转移杂交,以期建立BTV的核酸杂交诊断技术。本试验结果令人满意。     

地高辛标记核酸探针及其应用近况

地高辛标记核酸探针及其应用近况罗满林，李光富，蔡宝祥，陈溥言（南京农业大学２１００９５）核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆，检测感染性疾病的致病因子和诊断遗传病。最早使用的放射性同位素标记核酸探针，具有敏感性高，特异性好和分辨力强的特点，故沿用至今。但...     

凝胶电泳技术在蓝舌病毒核酸研究中的应用

本文应用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离、纯化蓝舌病毒核酸,然后通过溴化乙锭染色或敏感的银染色显示其区带。结果表明此方法不仅简便、快速,而且具有较高的敏感性。     

用光生物素标记核酸探针的研究

用放射性同位素标记核酸目前还只局限在一些有条件的实验室进行。另外,放射性标记探针还有保存时间短,危害人身安全等缺点。 本文介绍用光生物素标记核酸探针的方法,它既保留了生物素标记的优点,而且比应用放射性同位素方便安全。它不用缺口翻译方法进行标记,只用可见光照射即可标记成核酸探针,不管是DNA、RNA,还是单链双链皆可进行标记。这样核酸探针标记技术被进一步简化,使其更有利于临床应用。     

蓝舌病毒核酸末端标记方法的研究

应用[γ—~(23)P]ATP对蓝舌病毒核酸进行末端标记,结果表明3’末端标记制备的探针的放射比强度明显高于5’末端标记,而5’末端脱磷后再标记的结果同样较为理想。应用3’末端标记法或5’末端标记法皆能获得高放射比强度的核酸探针,完全满足于核酸试验。     

反义RNA重组逆转录病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

为探求一种快速检测反义RNA重组逆转录病毒效价的新方法,用脂质体介导法将反义RNA重组逆转录病毒载体pLXSA、pLXSB分别转染包装细胞系PA317,经G418筛选,获得数个稳定的产毒细胞克隆,择优挑选7个细胞克隆扩增培养,收集细胞上清,用异硫氰酸胍-酚一步法提取病毒RNA,进行逆转录套式PCR,检测细胞上清中的反义RNA重组逆转录病毒效价,同时用传统方法(小鼠成纤维放大法)进行测定。2种方法检测结果的比较表明,逆转录套式PCR法的特异性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法,是一种敏感性高、特异性强、操作简便、快速的检测逆转录病毒效价的新方法。     

牛病毒性腹泻病毒三种核酸检测方法的比较

利用针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的常规RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)和RT-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)3种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行了检测,以比较3种核酸检测方法的优越性。结果显示,3种核酸检测方法中,real-time RT-PCR和RT-LAMP一样敏感,均能检测到10拷贝/μL,常规RT-PCR只能检测到1×104拷贝/μL,但临床样品检测表明,常规RT-PCR方法敏感度低,会造成一部分漏检,RT-LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较3种方法后,推荐用RT-LAMP结合real-time RT-PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛病毒性腹泻的检出率。     

核酸探针应用中存在的问题与解决对策

核酸探针作为诊断试剂已应用于人和家畜传染病、寄生虫病及遗传性疾病的临床检测和流行病学的调查。但由于存在特异性和敏感性等问题,限制了进一步在临床医学和临床兽医学上的推广。本文就当前的核酸探针做为诊断试剂在应用中存在的问题做一简述和分析,并介绍几种解决这些问题的新技术。     

鸭瘟病毒基因组核酸的制备

用鸭瘟病毒国内标准株DPV34F2接种 10～ 12日龄的非免疫鸭胚 ,37℃培养 5d后 ,收获清亮尿囊液 ,采用高速离心结合切向超滤的方法浓缩纯化含毒尿囊液。然后通过改进的酚∶氯仿抽提法提取其中的病毒基因组核酸 ,用 4对特异引物对抽提物进行PCR鉴定。结果表明 ,应用上述方法可以获得较完整的鸭瘟病毒基因组核酸     

寄生原虫核酸的研究进展

寄生原虫核酸的研究进展李祥瑞（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所１５０００１）自从列文虎克（Ｌｅｅｕ－ｗｅｎｈｏｅｋ）于１８世纪发现第一个原生动物Ｅｉｍｅｒｉａｓｔｉｅｄａｅ以来，至今记载的原生动物至少有６５０００种，其中绝大多数为寄生虫。如何对这数目庞...     

猪瘟病毒实时荧光核酸恒温扩增检测方法的建立与评价

为了建立猪瘟病毒(CSFV)实时荧光核酸恒温扩增检测方法,采用特异性磁珠RNA捕获探针从组织、血液、排泄物和培养物等样本中提取病毒核酸,进行实时荧光恒温扩增检测,与传统的实时荧光检测技术相比,本试验建立的猪瘟病毒SAT检测方法操作简便,耗时短,整个扩增过程在42℃恒温下完成,没有频繁的升降温过程,缩短了检测时间,50 min内可完成检测。该方法特异性强,对多种相关猪病病毒进行检测无交叉反应。该方法灵敏度高,与实时荧光PCR相比均可达到100个拷贝数。该方法适用于猪瘟病毒的快速检测和监测。     

新城疫热稳定性天然弱毒B95株核酸疫苗的构建

将含有新城疫热稳定性天然弱毒B95株F基因的重组克隆质粒 pGEM F用NotⅠ单酶切 ,电泳回收纯化目的片段 ,与同样用NotⅠ单酶切并经去磷酸化处理的真核表达载体 pcDNA3.1连接 ,构建了新城疫核酸疫苗 ,并用所构建的新城疫核酸疫苗与载基因阳离子脂质体结合进行了免疫试验 ,通过ELISA、淋巴细胞转化试验检测了核酸疫苗在鸡体内的表达。结果显示 ,表达产物作为抗原物质刺激机体产生了特异性应答反应 ,引起了机体特异性的体液免疫和细胞免疫 ,对新城疫强毒攻击的保护率为 75 %。     

减蛋综合征病毒核酸序列分析及基因扩增研究

从被ＥＤＳ－７６病毒感染的鸭胚尿囊液中提取病毒核酸，经ＰｓｔⅠ酶切后重组到ｐＴ７／Ｔ３α－１９的ＰｓｔⅠ位点，再转化到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中。在ＬＢ平板上筛选了一个ＥＤＳ－７６特异的ｐＴＥＺ·Ｐ２８重组质粒。用双脱氧末端终止法测定了该重组质粒中插入片段的一段核酸序列。在此基础上设计了一对引物，用这对引物成功地从ＥＤＳ－７６ＤＮＡ上扩增出了一个２０９ｂｐ的核酸片段。     

日本血吸虫重组多表位核酸疫苗的构建与免疫保护效果评估

为构建重组日本血吸虫多表位核酸疫苗,并通过小鼠免疫保护试验比较不同重组多表位疫苗诱导的免疫保护效果,筛选并以PCR方法扩增日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)、谷胱甘肽-S-转移酶(Sj28GST)的抗原表位和23ku膜抗原大亲水区(LHD-Sj23)的编码DNA片段,构建了pCMV-LHD-Sj23-BSj28,pCMV-BGCP-LHD-Sj23,pCMV-BGCP-LHD-Sj23-BSj28三种日本血吸虫多表位核酸疫苗;采用肌肉注射法接种昆明系小鼠;用日本血吸虫尾蚴攻击感染后,剖杀小鼠,计算减虫率。结果显示,3种重组的真核表达质粒在免疫小鼠中分别获得了6.30%,14.76%和64.95%的减虫率。表明该重组多表位核酸疫苗可诱导较高的免疫保护效果,获得的三价核酸疫苗pCMV-BGCP-LHD-Sj23-BSj28具有潜在的应用价值。