应用聚合酶链反应扩增鸡传染性喉气管炎病毒TK基因的研究

根据鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因的核苷酸序列设计并合成1对引物,用该引物对4株不同的ILTV进行PCR扩增.结果全部ILTV毒株均获得与试验设计相符的647 bp的扩增片段,而对其它6种禽病原体的扩增结果均为阴性;敏感试验表明,该引物能检出10 pg的ILTV DNA.     

鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gE基因的克隆及序列分析

根据鸡传染性喉气管炎病毒 (AILTV)美国农业部 (USDA)标准毒株的基因序列 ,在AILTVgE基因起始密码子上游和终止密码子下游设计了 1对引物 pAL1和 pAL2 。以AILTV王岗株DNA为模板 ,进行PCR扩增 ,得到约 1.5kb的片段 ,经酶切鉴定为AILTVgE基因。将此PCR产物与pUC19质粒载体用限制性内切酶PstⅠ消化、连接 ,转化JM 83大肠埃希氏菌感受态细胞 ,用限制性内切酶酶切和PCR方法鉴定阳性重组质粒 pRHE。对其进行测序后 ,与AILTVUSDA标准攻毒株的gE基因序列进行比较 ,发现其核苷酸同源性为 99.5 % ,所编码氨基酸的同源性为 99.2 %。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的扩增及酶切分析

以从内蒙古区分离的 2株传染性喉气管炎病毒 (ILTV)株的DNA为模板 ,用设计好的 1对引物对这 2株毒株的 gB基因进行了PCR扩增 ,并对扩增产物分别用BglⅡ、PstⅠ、HindⅢ限制性内切酶酶切分析。结果表明 ,2个分离株均能特异性地扩增出该病毒 gB基因片段 ,片段大小完全一致 ,为 2 .6kb ;扩增产物的酶切图谱与参考株完全一致。     

鸡传染性喉气管炎病毒中国王岗株糖蛋白gB基因克隆及鉴定

以ＰＵＣ１９质粒为载体构建了鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＥｃｏＲＩＤＮＡ文库。根据已经发表的澳大利亚ＩＬＴＶ－ＳＡ２株和英国ＩＬＴＶ－Ｖ８２２株的糖蛋白ｇＢ基因的核苷酸序列，设计并合成了一对引物，以ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ为模板，扩增出１．３３８ｋｂ的糖蛋白ｇＢ基因片段，用ＤＩＧ标记制备成核酸探针，从ＩＬＴＶＥｃｏＲＩＤＮＡ文库中筛选出阳性重组子，得到一个ＥｃｏＲＩ３．０ｋｂ的ＩＬＴＶＤＮＡ片段。经酶切分析表明，该３．０ｋｂＩＬＴＶＤＮＡＥｃｏＲＩ片段含有完整的糖蛋白ｇＢ基因，经ＰＣＲ和核酸杂交表明所克隆的糖蛋白ｇＢ基因是特异的。     

用PCR检查鸡传染性喉气管炎病毒感染

以鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）的ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，扩增片段经电泳及酶切分析证明大小及ＥＣｏＲＩ位点的位置均与设计结果相符，可以确定为ＩＬＴＶＴＫ基因片段。用此法检测５只发病鸡的气管拭子，气管和血清样品，均扩增出ＩＬＴＶＴＫ基因特异性的－７１３ｂｐ片断，证实为ＩＬＴＶ感染。该方法敏感、特异、快速，是禽病病原诊断中一种很有发展前途的方法。     

传染性喉气管炎病毒王岗株gB基因gC基因和gD基因的真核表达

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点,经过酶切、测序分析,筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒,分别命名为pCAGGgB、pCAGGgC、pCAGGgD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进行了纯化,将纯化后的质粒转染293T细胞,用间接免疫荧光技术检测了目的蛋白的表达情况。检测结果表明,目的蛋白得到了真实的表达。     

牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株与野毒株PCR鉴别诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ＴＫ基因和ｇＢ基因序列,应用Ｏｌｉｇｏ４．１程序设计两对引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２及ＰＢ１和ＰＢ２,分别对已构建的ＴＫ基因缺失（ＴＫ－）ＩＢＲＶ以及ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南１和云南２分离株进行了ＰＣＲ扩增。结果显示７株ＩＢＲＶＤＮＡ用引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２扩增均产生４５７ｂｐ的特异性片段,而ＴＫ－ＩＢＲＶ只出现１１０ｂｐ片段;用引物ＰＢ１和ＰＢ２对７株ＩＢＲＶＤＮＡ及ＴＫ－ＩＢＲＶＤＮＡ进行扩增均产生３３９ｂｐ的特异性片段;用此引物对其同属的伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）进行扩增,均未见特异性条带,从而证明该引物是特异的;ＰＣＲ的敏感性检测表明,该法可检测出３ｐｇ的病毒ＤＮＡ。所建立的方法可以鉴别野毒与ＴＫ－ＩＢＲＶ疫苗毒的感染。     

鸡传染性喉气管炎病毒的荧光抗体检测

建立了一种鸡传染性喉气管炎 (ILT)的荧光抗体检测技术 ,用荧光素标记ILT兔源超免疫血清抗体 ,对 15份人工感染ILT病鸡、5份ND病鸡和 10份健康鸡的气管分泌物进行了检测 ,并对该技术做了特异性和敏感性测定。结果显示 ,人工感染ILT病鸡的阳性检出率高达10 0 % ,ND病鸡和健康鸡的阳性检出率均为 0 ;该ILT兔源超免疫血清荧光抗体检测技术特异性强、敏感性高     

鸡传染性喉气管炎病毒单克隆抗体的建立及其应用

应用鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）作免疫原建立了８株分泌抗ＩＬＴＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株。这８株ＭｃＡｂ均具有荧光抗体的特性，没有中和病毒的能力，分１４属于ＩｇＧ２，ＩｇＧ３和ＩｇＭ。应用异硫氰酸荧光素标记ＭｃＡｂ，建立了直接荧光抗体试验，用其检测ＩＬＴＶ抗原与分离病毒的符合率为９２．８％。     

鸡传染性喉气管炎病毒核酸检测用定性标准物质的研制

本研究以鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗株为原料,通过病毒繁殖、外源病毒检验、灭活、冻干等步骤,成功制备鸡传染性喉气管炎病毒核酸检测用定性标准物质.采用荧光定量PCR方法对标准物质进行均匀性评估、稳定性监测以及由多家实验室合作定值,并对其进行了临床试用.结果 表明,所研制的标准物质纯净,均匀性和稳定性良好,定性准确...     

鸡传染性支气管炎北京地方株S_1基因的克隆与鉴定

利用反转录套式聚合酶链反应（ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）技术从北京地区３株鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株（ＢＪ１,ＢＪ２,ＢＪ３）中扩增出１０５４ｂｐＳ１基因高变区。利用限制性内切酶ＳｉｎⅠ和ＰｓｔⅠ的酶切位点分析图谱进一步证实了ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ的特异性。将３段Ｓ１基因分别克隆到ｐＵＣ１９质粒中,获得重组质粒ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ１,ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ２和ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ３。     

鸭瘟病毒TK基因的克隆及其分子特性分析

通过测定动物疫病与人类健康四川省重点实验室构建的鸭瘟病毒(duck plaque virus,DPV)DNA基因文库中重组质粒的DNA序列,得到了该病毒胸苷激酶(TK)基因的ORF.采用PCR扩增出了DPV TK基因并将其克隆到pMD18-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切(BamH Ⅰ Hind Ⅲ)鉴定,并利用生物信息学软件Genscan、ProtScale、SignalP2.0、Scansite、TMpred、Prosite、DNAStar以及在线Predictprotein等分析了TK基因的分子特性.结果显示,DPV TK具有疱疹病毒的典型特征,含有ATP结合结构域和核苷酸结合结构域2个功能结构域,且具有与功能相关的磷酸化位点和氨酰化位点;编码的多肽链中亲水区域大于疏水区域,是一种膜外蛋白.DPV TK基因与禽类疱疹病毒(α-疱疹病毒)的进化关系最近.     

传染性喉气管炎病毒WG株糖蛋白gD基因主要抗原区的表达

为表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gD蛋白,根据GenBank中登录的ILTV全基因组序列(EU675324)设计了1对引物,进行gD全基因的PCR扩增,产物经纯化后连接至pGEM-T Easy载体,进行序列测定,采用DNAStar软件分析gD蛋白的抗原性,选择抗原性强的第256～405aa的编码片段设计引物并进行PCR扩增,结果获得截短的gD基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化E.coli BL21(DE3)。经IPTG诱导后,获得大小为43.5ku的重组蛋白,命名为r-gD。Western-blot分析结果表明,r-gD具有较强的抗原性。     

河北省鸡传染性喉气管炎发病情况调查及地方毒株的分离与鉴定

鸡传染性喉气管炎 (ＩＬＴ )是由鸡传染性喉气管炎病毒(ＩＬＴＶ)引起鸡的呼吸道传染病。近年来 ,ＩＬＴ在全国许多地方发生或流行 ,河北省中南部地区也呈现典型的地方性流行 ,病死率达 10 %— 70 % ,严重影响了养鸡业的发展。为此 ,我们对这些地区ＩＬＴ的流行情况进行了调查 ,并采集病料 ,进行了病毒分离和鉴定。1　发病情况1992年以来 ,河北省各地一年四季都发生ＩＬＴ ,冬春季节发病尤为严重。部分地区表现为地方流行性 ;一些地区的鸡群症状较温和 ,表现为流泪、流涕、眼睑肿胀、食欲减退、产蛋量稍有下降 ,少有死亡现象 ,2— 4周可恢复…     

山羊痘弱毒疫苗株TK基因的克隆及序列分析

以提取的山羊痘弱毒疫苗株HLJ-V9 DNA为模板,设计特异性引物并进行PCR扩增,获得了2078 bp的DNA片段,并将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体。酶切鉴定、PCR鉴定和测序结果表明,成功获得了TK基因,获得的TK基因内存在一个KpnⅠ酶切位点和编码区的早期转录终止信号TTTTTN(T)T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明,弱毒疫苗毒株HLJ-V9 TK基因与参考毒株的同源性在95.5%~100%之间,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。     

传染性腔上囊病病毒HN01超强毒株VP2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株52-70株基因组序列,设计并合成了1对扩增IBDV VP2基因的特异性引物.以IBDV超强毒分离株HN01感染发病鸡腔上囊组织中提取的病毒RNA为模板,用RT-PCR扩增出了1.45 kb的cDNA产物,将扩增的IBDV HN01株VP2基因克隆于pMD 18-T载体上,获得了pMD 18-T-VP2重组质粒.将IBDV HN01株 VP2基因序列测定结果与已发表的其他IBDV毒株VP2基因序列进行分析比较,绘出系统进化树.结果表明,HN01株与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM、香港超强毒株HK46等非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大.     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从陕西省榆林市某蛋用种鸡场疑似肾型传染性支气管炎病鸡中分离到了1 株肾型IBV(定名为YL 04),并对分离病毒进行了血凝性、血凝抑制性、致病性、鸡胚矮小化、电镜特征等生物学特性鉴定及S1基因5′端的RT PCR鉴定。结果表明,该分离株经10 g/L胰酶处理后的各代病毒尿囊收集液均可凝集鸡红细胞;标准阳性血清可特异性地抑制其凝集性;可复制出与自然发病相同的病例;病毒传代物有明显的致鸡胚矮小化作用;透射电镜下可见有近似球形、直径100 nm左右的冠状病毒粒子;用RT PCR方法扩增到1 条373 bp的目的片段,其核苷酸序列与IBV CQ/01/2004株序列的同源性达98%。