兔出血症病毒与兔出血症病毒2型复合RT-PCR检测方法的初步研究

为建立用于兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)鉴别诊断的检测方法。根据Gen Bank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因,设计合成6对特异性引物和10条搭桥引物,采用RT-PCR和搭桥PCR技术分别获取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守区片段,构建重组质粒p MD-19T-RHDV2、p MD-19T-RHDV441和p MD-19T-RHDV294,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及人工感染RHDV样品和临床样品的应用,对RHDV与RHDV2的复合RT-PCR检测方法进行了初步研究。结果显示,建立的RHDV与RHDV2复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和RHDV2的VP60保守区基因片段大小为294 bp和435 bp,RHDV与RHDV2的检测限度分别为160和230个拷贝的靶基因片段,而p GM-T-EBHSV(已构建)、兔巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和沙门菌等病原的检测结果均为阴性。样品检测结果显示,人工感染样品的RHDV检出率为100%(5/5),30份临床检样RHDV和RHDV2检测结果均为阴性。     

兔红细胞免疫功能的研究

应用红细胞C3b受体花环(C3bRR)和免疫复合物花环(ICR)试验,对12只大耳白兔红细胞免疫功能进行检测,证实兔红细胞表面存在补体C3b受体(C3b receptor,C3bR),C3bR花环率为15.13%±3.55%,IC花环率为9.92%±1.81%,表明红细胞免疫系统(RCIS)的概念亦适用于兔.     

抗兔出血症病毒单克隆抗体的制备

用1∶10稀释的兔出血症病毒(RHDV)加等量佐剂乳化后接种BALB/C小鼠3次,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。通过用间接ELISA试验筛选、克隆出分泌抗RHDV单克隆抗体的杂交瘤细胞林E_3E_6。     

高硒对雏鸡红细胞免疫功能红细胞总数及血红蛋白含量的影响

将1日龄艾维菌肉鸡健雏300只随机分为5组,分别以基础日粮(含硒0.2mg/kg)和高硒日粮(含硒1、5、10、15mg/kg)饲喂6周,观察研究了高硒对红细胞免疫功能、红细胞总数和血红蛋白含量影响的动态变化.结果显示,当日粮中硒含量超过5mg/kg时,IC花环率升高,C3b受体花环率、红细胞总数和血红蛋白含量降低.表明,雏鸡摄入过量硒会导致红细胞免疫黏附功能降低,并表现贫血症状.     

兔出血症病毒与欧洲野兔综合征病毒复合RT-PCR检测方法的建立

为建立用于兔出血症病毒(RHDV)和欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)诊断鉴别的快速检测方法,根据GenBank中的RHDV和EBHSV基因组序列,设计合成5条特异性引物和9条重叠延伸引物,分别以通过重叠延伸PCR人工合成的EBHSV VP60基因中359bp基因片段构建的重组质粒pGM-T-EBHSV和RHDV RT-PCR产物构建的pGM-T-RHDV为模板,经过反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,初步建立了RHDV和EBHSV的复合RT-PCR检测方法,并对20份临床样品和5份RHDV人工感染样品进行了检测。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和EBHSV的特异性目的片段192bp和335bp,对2种病毒的检测限度均可达到50copies的目的基因片段,兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌和沙门氏菌核酸扩增均为阴性。样品检测结果显示,5份人工感染样品的RHDV检出率为100%,20份临床样品的RHDV检测为阴性。     

无血凝性兔出血症病毒VP60蛋白分子特性的分析及其在大肠杆菌内的高效表达

分离出1株在4、25、37℃条件下均不能凝集人"O"型红细胞的兔出血症病毒(RHDV),命名为SQ-1株;采用RT-PCR扩增获得病毒主要结构蛋白VP60蛋白基因,并对目的基因进行测序及分析;将目的基因定向克隆入原核表达载体pET-30a的多克隆位点,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,纯化重组蛋白,用Western-blot检测其反应原性。测序与同源性分析结果显示,该毒株属于RHDV抗原遗传变异株(RHDVa),所扩增的VP60基因的ORF为1 740bp,编码579个氨基酸残基,与世界上其他RHDV毒株的核苷酸序列的同源性为89.9%～98.0%,与已报道的无血凝特性的病毒株whn-1株及低血凝性的Rainham株的核苷酸序列的同源性分别为95.2%及90.8%。重组质粒经IPTG诱导后目的基因获得表达,重组蛋白与预期大小一致,分子质量约为60ku,主要以包涵体形式存在。Western-blot检测证实,纯化蛋白能够与RHDV阳性血清发生良好的杂交反应,说明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

猪和兔附红细胞体的体外培养

用RPMI1640和小牛血清按不同比例混合作为体外培养猪和兔附红细胞体的基础培养基,同时以去掉红细胞上自然感染的附红细胞体后的红细胞泥作为培养附红细胞体的寄生载体,进行猪和兔附红细胞体的体外培养。培养结果表明,以 RPMI1640 与小牛血清按 6∶4 比例混合,同时选用兔红细胞泥作为载体的培养效果最佳,接种感染了附红细胞体的猪、兔阳性红细胞后 24 h生长达到高峰,感染率分别为40.2%和31.0%,而采用猪红细胞泥作为培养载体时红细胞感染率无明显升高。     

低硒对雏鸡红细胞免疫功能和红细胞总数及血红蛋白含量的影响

选用1日龄艾维茵肉鸡120只,随机分成2组,硒缺乏组日粮由购自西昌冕宁的玉米、黄豆和小麦配制而成,硒含量为0.034 2mg/kg,以亚硒酸钠为硒源使日粮硒水平达0.2mg/kg作为对照日粮,试验期6周,观察低硒对红细胞免疫功能、红细胞总数和血红蛋白含量影响的动态变化。结果显示,低硒日粮导致雏鸡红细胞C3b受体花环率、红细胞数量和血红蛋白含量降低,IC花环率与对照组差异不显著。表明雏鸡长期饲喂低硒日粮可导致原发性红细胞免疫功能损伤。     

兔出血症病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种可视化的兔出血症病毒RT-LAMP检测方法,根据兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)的主要结构蛋白VP60基因的序列设计合成4条特异性引物,以重组pMD19-T-VP60质粒为模板,通过反应条件与反应体系优化,建立RHDV的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,测定RT-LAMP对RHDV的最低检测限,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,该RT-LAMP的最佳反应温度为62℃,反应时间为40 min,对RHDV的最低检测限为50 copies/L,常规RT-PCR的检测限为5×10~3copies/L,表明建立的RT-LAMP的灵敏度显著高于常规RT-PCR。建立的RT-LAMP的全部反应可在1 h内完成;反应结束后加入荧光染料Et Br可肉眼判定粉色为阳性,而棕色则为阴性,且与兔巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌、无乳链球菌及肺炎克雷伯菌无交叉反应。上述结果表明,建立的RT-LAMP简便、快速、灵敏、特异,且不需昂贵仪器设备,适合在基层推广应用。     

兔出血症病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据RHDV VP60基因保守序列设计1对特异性引物和1条探针,进行条件优化,检测重复性、敏感性和特异性,建立了RHDV TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,标准品浓度在2.8×10~6~2.8×10~2 copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.8×10~1copies/L的标准品阳性质粒,变异系数小于2%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的RHDV,为我国RHDV的检测及其定量检测的相关研究提供了一种可靠的技术工具。     

羊源肠球菌溶血素特性分析及其对兔红细胞作用的观察

对致羔羊脑炎肠球菌E129-3菌株溶血素进行检测分析,并利用光学显微镜和电子显微镜观察其对兔红细胞的作用,探讨了肠球菌溶血素的特性及溶血类型。结果表明,小白鼠、兔、犬红细胞对该溶血素最敏感,牛红细胞不敏感。该溶血素可以被DTT、Ca2 活化,被蛋白酶K、EDTA、Zn2 、Cu2 抑制。在培养后2 h,细胞浆内着色不一致或密度降低,5 h时红细胞数量明显减少,细胞膜较完整。提示,肠球菌溶血素为成孔蛋白类溶血素。     

兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定

为建立兔出血症病毒(RHDV)的检测方法及为变异株监测做储备,用蔗糖密度梯度离心法纯化的RHDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合,以昆虫细胞一杆状病毒表达的重组VP60蛋白建立的间接ELISA法筛选抗RHDV单克隆抗体杂交瘤细胞,并对其主要生物学特性进行了鉴定.结果表明,筛选出6株单抗,它们分属于IgG1(AD4,AG10,DE2)、IgG2b(BC9,BE8)和IgM(BH3)亚类;这6株单抗杂交瘤细胞的平均染色体数为87～89条,将其冻存6个月后复苏,在体外传20代的过程中分泌的抗体效价变化不大,具有很好的稳定性;Western-blot及免疫荧光分析表明,单抗DE2、AG10识别线性表位,其余4株单抗识别构象型表位;竞争ELISA试验表明,这6株单抗可识别5种抗原表位.     

兔瘟兔外周血液和淋巴组织中T淋巴细胞的动态观察

作者对实验感染兔瘟兔外周血液和淋巴器官非特异性酯酶标记淋巴细胞进行了动态观察,旨在了解本病发展过程中,机体免疫状态的变化。 (一)材料和方法 1.家兔人工接种:选择动物接种的病料及程序均按兔瘟病理组织学研究一文介绍的方法进行(贺宏斌等),共接种家兔27只,另取6只为淋巴器官组织酯酶染色对照。 2.血液涂片酯酶染色:参照谭诗文、侯西庚     

弓形虫单克隆抗体试剂的研究——应用RIHA及IHA法对弓形虫感染兔、羊循环抗原和抗体的检测

应用抗弓形虫单克隆体(McAb)致敏绵羊红细胞建立的反向间接血凝诊断法(RIHA)和间接血凝诊断方法(IHA),对人工感染弓形虫的兔、羊血清进行了循环抗原(CAg)和抗体(Ab)检测。结果表明,弓形虫弱毒(QHO)株和强毒(RH)株感染的兔和羊血清,用RIHA检出CAg的时间在感染后1～2天,平均4天;IHA检出Ab的时间在感染后8～16天,平均12天。用毒力不同的弓形虫感染后,CAg检出时间有一定差异:QHO株感染的兔平均5.3天,羊平均6.25天;RH株感染的兔平均2.3天,羊为1天。兔、羊CAg的阳性检出率均为100％。兔、羊血清CAg于感染后23～66天先后消失,而Ab滴度长期维持在一定高度(1:64～1:4096)。证明RIHA方法对不同毒力弓形虫感染的动物血清CAg可以达到早期诊断的目的。为弓形虫病急性期和早期现症感染提供了可靠的诊断方法和手段。     

兔瘟、巴氏杆菌病二联苗的研制和应用

(一)材料与方法1.兔瘟种毒:川农乐系毒株(由余广海从乐山发病兔群分得),经测试合格;川厂旋口系每株(由蒋元林从汉川旋口分得),经测试合格。2.兔巴氏杆菌菌种:兔源A型厂1号(厂兔群中分得),兔源A型农大Ⅰ、Ⅱ两株(余广海分得),经江苏牧医所和川农谢锐怀鉴定合格;禽源A型48-1株(中监所提供);兔源A型51-2株(中监所提供)。3.试验动物:由生药厂实验动物繁殖场和四川农大兽医学系教学实习兔场提供。4.仪器、药品、培养基、人型红细胞:均由四川兽医生药厂提供。     

高原引进兔部分血液学指标的测定

用间接测定法(T1824)对引进海拔3000 m的加里福尼亚兔和当地饲养多年的中国白兔、青紫蓝兔部分血液学指标进行了测定.结果所测兔红细胞比容、血浆容积、红细胞容积和总血量与低海拔地区兔相比均有不同程度增高;其中所测兔红细胞比容、血浆容积和总血量在其品种、性别之间差异显著(P＜0.05)或差异极显著(P＜0.01).     

碎米蕨叶马先蒿对小鼠肝肾和血液指标的影响

为探讨碎米蕨叶马先蒿对动物机体的损害程度,以评价其安全性,本试验将采自新疆巴音布鲁克草原的碎米蕨叶马先蒿粉碎,自制含15%和30%的碎米蕨叶马先蒿草粉鼠粮,饲喂小鼠三个月以上,随机抽取小鼠血液进行生化指标天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、尿素(BUN)、肌酐CRE的测定和血常规红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、淋巴细胞绝对值(LYMPH#)、淋巴细胞(LYMPH)百分数、中性粒细胞(NEUT)比率和单核细胞(MONO)比率的测定。生化指标结果显示,高剂量组碎米蕨叶马先蒿对小鼠肝脏可能造成轻微损害,对小鼠肾脏可能造成损害;血液学检测结果显示,在试验第28天时WBC、LYMPH百分数、LYMPH#高剂量组极显著高于对照组(P<0.01),NEUT比率和MONO比率显著低于对照组(P<0.05)。在血液学检测整个试验期间,各测定指标都在不断波动,试验后期均趋于动态平衡。上述结果表明,30%碎米蕨叶马先蒿草粉鼠粮对小鼠肝脏可造成轻微损伤、对肾脏造成损伤,但不影响造血系统。     

鹅副粘病毒的分类地位初探

对从病鹅体分离的禽副粘病毒(GPV)YG97株,经红细胞凝集(HA)和红细胞凝集抑制(HI)试验证明,与新城疫病毒(NDV)存在着极大的相关性.参考NDV的3个毒力指标--最小致死量致病鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄非免疫雏鸡静脉接种致病指数(IVPI),对YG97株进行测定,表明其具有与NDV速发型类似的毒力,属强毒力的毒株.应用RT-PCR技术对F基因重要功能区片段扩增后进行序列测定,并与多株已报道的NDV相应片段进行序列比较,经遗传进化树分析后,初步判定其为禽副粘病毒-Ⅰ型,属基因Ⅶ型NDV.     

用醛化红细胞分离抗禽流感病毒独特型多克隆抗体

用纯化的鸡抗禽流感病毒(AIV)抗体免疫家兔,制备抗独特型多克隆抗体;用戊二醛醛化的红细胞固定非特异性鸡抗体,再吸附兔抗鸡抗体,获得了纯的抗独特型抗体。经鉴定,该抗体既有弱的血凝性又有弱的血凝抑制性,并能与原病毒竞争性地和鸡抗AIV抗体结合。     

人工感染艾美球虫对兔血液学数值的动态研究

将20只健康兔随机分成试验组和对照组,每组10只,试验组每只兔按100 g体重经口灌服混合孢子化卵囊5×104个,对感染前后兔红细胞总数、白细胞总数、白细胞分类计数及T淋巴细胞阳转率的动态变化进行了测定.结果试验组兔红细胞总数、淋巴细胞百分率及T淋巴细胞阳转率分别于感染后5～20 d、5～30 d和10～30 d均显著低于对照组(P＜0.05),30 d时的红细胞总数比对照组增加55.93%;白细胞总数和嗜中性白细胞百分率分别在感染后10～30 d和20～30 d显著升高;嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞及单核细胞无明显变化.由此表明,使用致死剂量的球虫卵囊感染兔,其致死的部分原因是因机体失血过多、抵抗力和免疫力下降所致.