锦鲤疱疹病毒CJ株ORF83基因的克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ)ORF83蛋白的结构特征和进化关系,用框镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF83基因,将其克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF83基因的结构和功能,并与GenBank上已公布的3株KHV构建系统进化树。结果显示,获得了长687 bp的ORF83基因,编码229个氨基酸;编码蛋白的理论分子质量为25 822.18 u,等电点为8.600;疏水性为-2.733～3.100;信号肽切割部位最可能位于第22位的G(甘氨酸)和第23位的V(缬氨酸)之间;跨膜结构分析表明,ORF83有4个跨膜区;抗原表位预测显示,编码蛋白的抗原性良好;结构预测显示,ORF83可能存在1个N-糖基化位点、11个O-糖基化位点和13个磷酸化位点;系统进化树分析显示,KHV-CJ株与锦鲤疱疹病毒美国株和以色列株属同一分支。结果表明,ORF83基因编码的蛋白可能具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体。     

鸭瘟病毒TK基因的克隆及其分子特性分析

通过测定动物疫病与人类健康四川省重点实验室构建的鸭瘟病毒(duck plaque virus,DPV)DNA基因文库中重组质粒的DNA序列,得到了该病毒胸苷激酶(TK)基因的ORF.采用PCR扩增出了DPV TK基因并将其克隆到pMD18-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切(BamH Ⅰ Hind Ⅲ)鉴定,并利用生物信息学软件Genscan、ProtScale、SignalP2.0、Scansite、TMpred、Prosite、DNAStar以及在线Predictprotein等分析了TK基因的分子特性.结果显示,DPV TK具有疱疹病毒的典型特征,含有ATP结合结构域和核苷酸结合结构域2个功能结构域,且具有与功能相关的磷酸化位点和氨酰化位点;编码的多肽链中亲水区域大于疏水区域,是一种膜外蛋白.DPV TK基因与禽类疱疹病毒(α-疱疹病毒)的进化关系最近.     

鸭瘟病毒UL24基因的分子特征分析

根据本实验室获得的鸭瘟病毒的一段基因序列设计引物,利用PCR扩增UL24基因并克隆到pMD18-T载体,阳性重组质粒进行酶切鉴定、测序验证与生物信息学分析.结果显示,获得的UL24基因全长1 230 bp,编码409个氨基酸;与其他26株疱疹病毒科中α-疱疹病毒亚科的UL24基因的相似性较β和γ亚科高,其中与α亚科禽疱疹病毒属中的GaHV-3相似性最大(34.7%);遗传进化树显示,该基因编码的蛋白与火鸡疱疹病毒的UL24蛋白的亲缘性最近.该蛋白是一种保守但不舍信号肽的外膜蛋白,具有5个潜在的N-糖基化位点和19个磷酸化位点;编码的氨基酸Ala,Apn,Glu,Phe,Leu,Arg,Thr,Val具有一定的偏嗜性.二级结构分析显示,α螺旋和无规卷曲含量高,均达46.94%,而β折叠仅占6.11%;同源建模比对,未发现与之匹配的三级结构;预测的抗原表位主要位于肽链第36～48、241～323、344～379位区段.     

鸭瘟病毒UL26.5基因的克隆和编码蛋白的亚细胞定位

对鸭瘟病毒(DPV)UL26.5基因(GenBank登录号EF643564)的分子特征分析表明,其具有疱疹病毒支架蛋白的典型特征,含有6个保守的结构功能域和1个丝氨酸蛋白酶水解位点(M位点),且具有与其功能相关的磷酸化位点;编码的多肽链是一种膜外蛋白.DPV UL26.5与α-亚科禽类疱疹病毒属的进化关系最近.将UL26.5基因扩增产物亚克隆至pET-32a(+)原核表达载体,并转化至E. coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得一约59 ku的表达蛋白,与预期大小一致.将重组蛋白纯化后,制备兔抗血清,经间接ELISA检测,效价达1:204 800.DPV UL26.5基因编码蛋白亚细胞定位检测结果显示,最早可在感染后10 h的细胞核中检测到该蛋白,12 h后细胞核中出现较多绿色荧光,48 h时细胞质中也出现少量荧光.试验结果为进一步开展DPV UL26.5基因功能的研究提供了重要数据和材料.     

单核细胞增生李斯特菌野毒株prfA基因的克隆及其分子特征分析

利用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(LM)TA野毒株prfA基因进行扩增,将其克隆后测序,并对该分离株prfA基因及其编码蛋白进行分子特征和遗传变异分析。结果显示,TA株prfA基因全长为714bp,编码237个氨基酸。通过对推导的prfA蛋白氨基酸序列结构域分析发现,该蛋白从N端到C端分别包括1个β-环结构域(18～97aa)、1个α-螺旋构成的C区(110～136aa)、1个α-螺旋构成的D区(136～155aa)、1个由螺旋-转角-螺旋构成的HTH结构域(170～196aa)和1个由α-螺旋构成的亮氨酸拉链G区结构域(211～237aa)。通过对GenBank中登录的35株分离株prfA基因遗传变异分析发现,不同地域分离株的prfA基因在核苷酸水平以点突变为主;TA株第197位氨基酸由赖氨酸(Lys,K)突变为天冬氨酸(Asn,N)。     

猪巨细胞病毒SC株DNA聚合酶基因的克隆及生物信息学分析

为克隆出猪巨细胞病毒SC株DNA聚合酶(DPOL)基因并对其进行分析,根据GenBank中的DPOL基因序列(AF268040)设计了1对引物,用PCR法扩增出猪巨细胞病毒SC株DPOL基因,将其克隆到T载体,测序并进行生物信息学分析。测序结果表明,猪巨细胞病毒DPOL基因全长3 024bp,为一个完整ORF,共编码1 008个氨基酸;与参考毒株的核苷酸同源性为98%,系统进化树表明猪巨细胞病毒与人疱疹病毒6型和7型关系最近;运用生物信息学软件推导出该蛋白的基本性质,并预测出高级结构。成功地进行了猪巨细胞病毒SC株DPOL基因的克隆和生物信息学分析,为今后此基因生物学功能和猪巨细胞病毒复制机理的研究以及病毒系统分类工作提供了参考。     

猪伪狂犬病病毒gC基因的克隆及其部分生物学特性的分析

采用PCR方法扩增出12株伪狂犬病病毒(PRV)的gC基因全序列,并测序,使用生物学软件对这12株PRV gC基因序列和GenBank上登录的6条gC基因序列进行了生物信息学分析和预测.结果显示,PRV gC基因开放阅读框的核苷酸长度为1437～1464 bp,编码478～487个氨基酸.在遗传进化关系上,四川省流行的PRV毒株与日本、欧洲、美洲分离株的亲缘关系较近,而与我国其他地区的分离株亲缘关系较远.这些毒株的蛋白疏水性、抗原表位和高级结构等具有相似性,但也存在一些变化和差异.表明,PRV gC基因具有较高的保守性,但可能存在抗原漂移现象.     

鲤疱疹病毒2型ORF5截短基因的克隆表达及免疫原性研究

根据G en Bank上已登录的鲤疱疹病毒2型的O RF5基因序列(登录号:AFJ20457.1)设计1对引物,采用PCR扩增技术获得目的基因。序列分析表明,目的基因长357 bp,是一个完整的开放阅读框,编码119个氨基酸,理论分子质量为13 059.70 u,无信号肽,无跨膜区,含有4个抗原表位。将扩增片段克隆至原核表达载体p ET-32a中,并将获得的重组质粒转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。对表达蛋白进行复性纯化后免疫小鼠和异育银鲫,SD S-PAGE和W estern-blot检测分析表明,重组蛋白的分子质量约为33 ku,与预期相符,表达形式为包涵体,该蛋白能够与抗H is标签的抗体发生特异性反应,也能识别病毒粒子上的ORF5蛋白。对免疫的异育银鲫进行攻毒,结果显示注射生理盐水组的银鲫保护率为0,注射15、25、50 g重组蛋白组的保护率分别为20%、30%、35%,表明免疫重组蛋白组的保护率高于对照组。本研究证实了表达的融合蛋白具有一定的免疫原性,丰富了鲤疱疹病毒2型ORF5基因及基因组的研究,为研发制备新型鲤疱疹病毒2型的疫苗和诊断试剂盒奠定了基础。     

FMDV全ORF编码基因的克隆及其腺病毒穿梭质粒的构建

为研制FMD复制缺陷型腺病毒活载体疫苗,通过RT-PCR方法获得了O型口蹄疫病毒(FMDV)全开放阅读框(ORF)基因片段,将其克隆到pMD18-T载体后测序,再将ORF编码基因定向克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建了重组腺病毒穿梭质粒。经PCR、酶切及测序鉴定,所克隆的ORF编码基因序列与原始强毒株Akesu/58的ORF编码基因比较,L、P1、P2、P3基因的核苷酸同源性分别为98.8%、97.9%、99.0%和97.6%,PCR、酶切鉴定重组腺病毒穿梭质粒均获得了长约6.9 kb的目的基因片段。表明,成功获得了含有O型FMDV全ORF编码基因的阳性克隆,并成功构建了含有完整FMDV开放阅读框架的编码基因表达盒的重组腺病毒穿梭质粒。     

马动脉炎病毒大囊膜蛋白和膜蛋白基因的克隆与序列分析

参考GenBank收录的马动脉炎病毒(EAV)读码框大囊膜蛋白基因 ORF5、膜蛋白基因ORF6的核苷酸序列,分别设计了2对引物,对EAV的这两种主要结构蛋白基因进行了 RT PCR;将扩增产物克隆于pUC18通用载体,对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实克隆片段的可靠和准确性。测序结果,ORF5目的片段包含768 bp,编码255个氨基酸组成的多肽;ORF6目的片段包含489 bp,编码162个氨基酸组成的多肽。与EAV NC 002532标准毒株比较,ORF5、ORF6核苷酸的同源性分别为99.1%和99.4%;推导氨基酸的同源性分别为96.9%和98.2%。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

云南省红河州山羊流产病原的调查

针对红河州山羊妊娠期流产严重的现象 ,进行了流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、实验室诊断、人工感染试验和治疗试验。结果发现 ,妊娠母山羊流产现象覆盖全州 ,且流产率以每年 11.5 0 %的速度递增 ,弓形虫抗体阳性率为 30 .82 % (12 10 / 392 5 ) ,衣原体抗体阳性率为32 .31% (12 6 8/ 392 5 ) ,其中弓形虫和衣原体双重感染阳性羊占 9.35 % (36 7/ 392 5 ) ,未检出布鲁氏菌抗体阳性羊 ;自流产胎儿肺抹片中发现弓形虫滋养体包囊 ,7份流产胎儿中有 6份分离到衣原体 ;用土霉素及复方新诺明治疗有明显效果 ;人工感染试验能复制出与自然病例相同的病例模型。调查结果表明 ,红河州广泛流行的山羊妊娠期流产的病原是弓形虫、衣原体 ,2种病原单一感染或混合感染是造成流产的主要原因。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。