东北虎感染猫泛白细胞减少症的研究——综合诊断

本文根据武汉动物园3只7月龄同窝幼虎相继发生以高热、腹泻、呕吐和白细胞减少为特征的临床症状,经过流行病学调查、病理剖检、血凝试验、人工感染试验,初步确诊东北幼虎患的是猫泛白细胞减少症。     

猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其结构蛋白VP2可溶性表达的调控

为了研究猫泛白细胞减少症病毒（FPV）的生物学特性,可溶性表达FPV结构蛋白,研发基于VP2的新型亚单位疫苗,采集40份疑似FPV阳性的中华田园猫粪便样本,通过qPCR对样本检测后利用细胞培养、血凝试验、PCR和电镜观察等试验鉴定分离株,并对其VP2基因进行同源性比对。同时,构建pET-28aVP2、pET-28a-SUMO-VP2和pET-22a-SUMO-VP2重组质粒并利用大肠杆菌进行表达。结果显示,成功分离出1株FPV毒株;生物信息学分析表明,该毒株的VP2基因与此前报道的毒株同源性高达99%。蛋白表达结果显示,单独使用SUMO标签对VP2蛋白的可溶性表达影响较低;然而,当带有SUMO标签的重组质粒与4个分子伴侣（p G-KJE8、pGro7、pKJE7、pTf16）分别共表达时,可溶性VP2的表达量可显著提高。该研究可为FPV亚单位疫苗研发提供数据和有效的生物材料。     

猫钩虫PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、敏感的检测猫钩虫的方法,根据钩虫内转录间隔区(ITS)部分序列的保守引物AF和AR,建立PCR检测方法,对反应条件进行优化,并进行特异性和敏感性试验;采用该方法对112份流浪猫粪便进行临床检测。结果显示,建立的PCR方法能特异性扩增猫钩虫相应的基因片段,其长度为404bp,与猫弓首蛔虫、犬复孔绦虫、狐毛尾线虫的虫卵的基因组DNA以及蓝氏贾第虫包囊、猫等孢球虫卵囊基因组DNA无交叉反应;最低能检测到1.07fg的钩虫基因组DNA。通过临床样品检测,该方法比碘液染色镜检的检出率提高了9%,其敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均为100%。结果表明,该PCR方法具有敏感、特异的特点,适用于钩虫的临床检测和钩虫病的分子流行病学调查。     

猫杯状病毒纳米PCR检测方法的建立

为了提高猫杯状病毒(FCV)的检测效率,参考FCV全基因组序列的保守区域,利用生物学软件Primer Premier 5.0设计1对FCV特异性引物,并建立了FCV纳米PCR检测方法.结果显示,该方法特异性良好,与其他常见的猫病毒性病原均无交叉反应;该方法敏感性良好,最低检测量为5.4×10-3 pg/μ L的标准品,...     

猫疱疹病毒ERA-LFD检测技术的建立与应用

为建立一种快速检测猫疱疹病毒(FHV)的酶促恒温扩增-横向流动试纸条(ERA-LFD)方法,根据GenBank上FHV TK基因保守区域序列,设计多对ERA特异性引物用于筛选最佳引物对及探针,以现场快速检测FHV.灵敏性试验表明,该方法的检测限为7.86×101 copies/μL,比普通PCR的检测下限高10倍,与实...     

猫泛白细胞减少症病毒的分离与鉴定

猫泛白细胞减少症(Feline panleukopenia,FP)又名猫瘟热(Feline distemper,FD)或猫传染性肠炎(Feline infectious enteritits,FIE)是由细小病毒科、细小病毒属中的猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)引起的对猫科动物危害极大的一种病毒性传染病。1928年Verge和Cristoforoni证明该病是由病毒引起,1964年Johnson从云豺体内第一次成功地分离出该病毒,以后又有许多国家成功地分离到该病毒。我国李刚等于1985年首次在家猫中分离到该病毒,并证明了该病在我国的流行。该病毒在自然条件下除猫以外,还可感染狮、虎、豹、貂等多种猫科和鼬科动物。近年来在昆明市花鸟市场中虽多次有疑似本病的疫情发生,但未能确诊。     

猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的方法,本研究根据GenBank上登录的FHV-1 UL55序列设计特异性探针及引物,筛选最佳引物对,建立了FHV-1的重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。该方法在39℃反应20 min即可快速、特异性地检测FHV-1。灵敏性试验结果显示,RAA最低检测限为7.60×10¹ copies/μL,比普通PCR最低检测限高100倍。特异性试验结果显示,该RAA方法与猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫细小病毒无交叉反应。对34份临床样本进行检测,其中13份为阳性,阳性检出率为38.23%。综上所述,本研究成功建立了猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法。     

猫细小病毒和猫疱疹病毒1型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时检测猫细小病毒（FPV）和猫疱疹病毒1型（FHV-1）的双重荧光定量PCR方法,针对FPV的VP2基因、FHV-1的UL21基因设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了双重荧光定量PCR方法,并绘制了标准曲线,其相关系数（R2）均为0.999,具有良好的线性关系。结果显示,FPV、FHV-1最低检测限分别为4.87和2.21 copies/μL;对猫的常见病毒及细菌均无非特异反应;批内、批间试验的变异系数均小于2%。证明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好。用建立的方法对178份样本进行检测,结果,FPV和FHV-1的阳性检出率分别为73.65%和16.85%,二者混感阳性率为15.73%,与临床确诊结果一致。上述结果表明,本研究建立的方法可用于FPV、FHV-1感染的早期诊断、定量检测和流行病学调查等。     

猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种高效准确检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的实时荧光定量PCR方法,以FIPV N基因为靶基因设计特异性探针和引物,构建质粒标准品。通过优化反应条件,建立real-time PCR方法,并进行临床检测。经方法优化,所建立方法的标准曲线为y=-3.137x+42.243,R²值为0.999,扩增效率E为108.0%。该方法与猫瘟病毒(FPV)、猫疱疹病毒(FHV)和猫杯状病毒(FCV)无交叉反应,特异性良好;检测最低拷贝数为9.250 copies/μL,比常规PCR方法高出100倍;组内、组间变异系数均小于5.0%,重复性好。采用建立的方法和EvaGreen real-time PCR方法对39份临床样品进行检测,结果,检出阳性样品数分别为24和22,经Kappa检验,两者高度一致。上述结果表明,本研究成功建立了高效、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,可用于FIPV的临床病例检测。     

牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒及牛支原体三重Nano-PCR方法的建立与初步应用

为了同时检测临床上牛常见的三种呼吸道重要病原体,本研究针对牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）和牛支原体（MB）保守基因进行引物设计,并成功构建标准阳性质粒。使用纳米金颗粒将普通PCR方法优化,建立了三重Nano-PCR检测方法。结果显示,三重Nano-PCR检测方法可同时检测出BVDV、IBRV和MB的阳性质粒（1μL）最低检测分别为1 fg、100 ag、10 fg,灵敏度分别为常规PCR的10、10、100倍。临床结果显示,30份采集于临床呼吸道病牛样品中,BVDV、IBRV和MB的Nano-PCR的检测阳性率分别为33.33%、36.67%、33.33%,而普通PCR的检测阳性率分别为26.67%、30%、20%,提示BVDV和IBRV混合感染最多,阳性率可达26.67%。三重Nano-PCR方法特异性良好,检测其他牛呼吸道相关病原体BCV、BPIV3和BRV时结果均呈阴性。本研究建立的快速灵敏且特异良好的三重Nano-PCR检测方法可广泛应用于临床诊断和流行病学筛查。     

猪乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×10¹～7.2×10⁸ copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×10⁰copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。     

用醛化猪红细胞进行猫泛白细胞减少症病毒血凝试验

猫泛白细胞减少症(FPL )的病原是猫泛白细胞减少症病毒(FPLV),系细小病毒成员,又称为猫细小病毒(FPV)。本病在我国,据报道(张振兴等,1984)已成为当前最严重的猫病之一,本病可用血凝(HA)试验检测病猪粪便中的病毒而作出诊断。然而,应用新鲜猪红细胞作HA试验存在着不易长时间保存,不同个体的红细胞间有差异,以及有些个体的红细胞存在自凝现象等缺点。所以,我们进行了醛化猪红细胞的HA试验,得到了较好的效果。     

阿卡斑病毒荧光RT-RAA快速检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测阿卡斑病毒(AKAV)的分子生物学检测方法,本研究通过比较分析AKAV基因组序列,在S基因保守序列区域设计重组酶介导等温扩增(RAA)引物及探针,筛选最佳引物对,然后对RAA反应温度、引物浓度以及探针浓度进行优化,建立了AKAV的荧光逆转录重组酶介导的核酸等温扩增(RT-RAA)快速检测方法。结果显示,所建立的荧光RT-RAA方法在42℃反应20 min即可快速检测出AKAV,检测下限可达6.26×10¹copies/μL,与牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等无交叉反应,并具有良好的重复性。对37份临床样品进行检测,阳性检出率为43.24%,与RT-qPCR检测结果符合率为94.59%。结果表明,建立的AKAV荧光RT-RAA快速检测方法具有快速、特异、灵敏、稳定等特点,可为AKAV的现场快速检测提供可靠方法。     

羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒(CaPV)末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法.结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性.与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性.表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测.     

猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能够准确、快速地鉴别猪肠病毒G型的诊断方法,本研究参考猪肠病毒G型的3D基因序列设计1对特异性引物,扩增片段预计大小约为104 bp,将3D基因片段克隆到pMD18-T载体上的阳性重组质粒作为标准品,建立猪肠病毒G型的实时定量PCR检测方法,并应用到临床样品的检测。研究结果显示,该方法设计的引物具有高度的特异性;标准曲线的Cq值与质粒标准品模板在2.92×10^8copies/μL^2.92×10^2copies/μL范围内,呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-4.023;组内与组间重复性试验显示变异系数很小,在0.26%~1.57%之间。该方法的最低检测限量可达2.92×10 copies/μL。使用本方法对2017-2019年广西部分地区的猪场临床腹泻粪便样品进行检测,猪肠病毒G型阳性检出率为18.42%,说明广西部分地区的猪场存在猪肠病毒G型的感染。本研究成功建立了猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法,可用于猪肠病毒G型感染的临床检测。     

禽呼肠孤病毒纳米PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感的禽呼肠孤病毒(ARV)检测方法,针对ARV S3基因的保守区域设计1对特异性引物,建立了ARV纳米PCR检测方法。结果显示,该方法特异性好,仅从ARV核酸样品可检测到约332 bp的特异性目的条带,而对新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒、鸡毒支原体、马立克病病毒、传染性喉气管炎病毒、鸭瘟病毒、禽腺病毒Ⅳ型、减蛋综合征病毒、H9亚型禽流感病毒和鸡大肠杆菌等其他病原的检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该纳米PCR方法能检测到的最低核酸质量浓度为56 pg/L,其灵敏度是普通PCR的10倍。ARV核酸被重复检测3次,结果均一致。应用建立的纳米PCR和病毒分离鉴定方法对临床送检的30份样品进行检测,两种方法的符合率为100%。以上结果表明,成功建立了ARV的纳米PCR检测方法,具有更高的敏感性和良好的特异性,可用于ARV感染的临床诊断及流行病学调查。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,并将其应用于临床样品FHV-1的快速检测。根据GenBank已发表的FHV-1 TK基因序列的保守区域设计合成1对引物,通过对反应体系的优化,建立了FHV-1 PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、稳定性。结果显示,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法对猫杯状病毒(FCV)、猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)均无交叉反应;可检测病毒DNA模板的最低浓度为3.78×101copies/μL;应用该方法从22份猫临床样品中检出17份FHV-1核酸阳性样品。上述结果表明,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法特异、灵敏、快速、可重复,适合于临床FHV-1的快速检测。     

猪库布病毒纳米PCR快速检测方法的建立

为了给临床检测猪库布病毒(PKV)提供更加准确便捷的检测方法,本试验设计了1对特异性引物,扩增PKV基因组的VP0区域。在传统PCR反应体系中添加纳米金颗粒材料,优化后建立了一种方便快捷且特异检测PKV的nano-PCR方法。结果显示,该方法能特异性扩增猪库布病毒,与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒均无交叉反应。nano-PCR相对于普通PCR表现出更高的敏感性,普通PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-7ng/μL,而nano-PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-10ng/μL,敏感性提高了1 000倍。对来自不同发病猪场30份腹泻猪的粪便和血液临床样本的检测结果显示,nano-PCR阳性检出率为23.33%(7/30),普通PCR阳性检出率为16.66%(5/30)。结果表明,本试验建立的nano-PCR方法在猪库布病毒的检测中表现出更高的特异性和敏感性,对猪库布病毒的快速诊断和检测具有重要的临床意义。     

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验.结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×102...     

鹅细小病毒强毒PCR检测方法的建立

参照GenBank中登录的鹅细小病毒 (GPV)B株的全基因序列 ,针对GPV的VP3保守基因设计了 1对引物 ,建立了GPV的PCR检测方法。采用该方法检测GPV能够扩增出预期大小约 4 41bp的特异性片段 ,而对鸭瘟病毒 (DPV)、鹅源致病性大肠埃希氏菌 (E .coli)O8和O1、雏鹅新型病毒性肠炎病毒 (NGVEV)呈阴性反应。该法检测GPV核酸的灵敏度可达 0 .4 7pg ;对GPV强毒皮下注射感染雏鹅各器官的检测结果表明 ,感染后 8h即可从心、肝病料中检出病毒DNA ,感染后 2 4h可从延髓、胸腺、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠、腔上囊、心、肝、脾、肺、肾、血液、小脑、直肠、肌肉、粪便中检出GPVDNA ,感染 4 8h后可从骨髓中检出病毒DNA ,感染 312h后仍能从十二指肠、空肠、盲肠、心、肝、肾、粪便中检出病毒DNA。病毒分离阳性的可疑病料PCR检测为阳性 ,对临床送检病料的检测结果表明 ,PCR的敏感性显著高于病毒分离。