胎羊与成年绵羊原代肝细胞的分离培养与鉴定

为了获得稳定、可持续传代的绵羊肝细胞,采集110～120 d的绵羊胚胎肝和正常未怀孕成年绵羊肝,用胶原酶两步灌流法分离肝细胞;用PAS染色法和CK-18免疫荧光法鉴定细胞;用CCK-8测定肝细胞第6、12、24、36、48、60、72和96小时的D450值,绘制生长曲线.结果 显示,获得的绵羊原代肝细胞形态完整,贴壁良...     

鸡传染性贫血病毒的分离鉴定

在山东省从死亡率达７２％、混合感染多种病原微生物的海兰白蛋鸡和艾维茵肉鸡群中分离到３株鸡贫血病毒（ＣＡＶ），这些毒株耐体积分数５０％氯仿和７０℃水浴１５ｍｉｎ，能在ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞内增殖。用分离的细胞毒接种１日龄ＳＰＦ鸡呈现典型的鸡传染性贫血特征性的临床症状和病理变化；用间接免疫荧光检查感染的ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞涂片和鸡组织触片，可见特异的核内荧光。分离毒株能被ＣＡＶ－ＴＫ５８０３株抗血清所中和；５周龄ＳＰＦ鸡接种分离细胞毒可产生ＣＡＶ抗体；电子显微镜观察，分离毒株ＭＳＢ１细胞培养物中有大量２０ｎｍ左右的病毒粒子。应用特异性ＰＣＲ引物可扩增到预计长度的病毒核酸片段，进一步证实分离株为ＣＡＶ。     

腺胃型鸡传染性支气管炎病毒Hu98株的分离鉴定

1998年首次从哈尔滨市某鸡场鸡腺胃肿大为特征的病例中分离到IBV-Hu98毒株.将该病毒株接种SPF鸡胚并传至5代(F5),结果接种胚出现规律性死亡和典型胚胎病变特征,EID50为10-6.40/0.2 mL.IBV-Hu 98 F5感染SPF鸡胚尿囊液经负染电镜观察,可见直径为80～120 nm、有囊膜和纤突的冠状病毒粒子.用IBV-Hu98 F5毒株人工感染1日龄SPF鸡能引起与自然病例相似的病理组织学变化,死亡率为80%(4/5),用IBV-Hu 98J1人工感染1日龄SPF鸡死亡率为100%(5/5),并可从死亡鸡中分离到冠状病毒.     

广西鸡毒霉形体的分离与鉴定

从广西不同地区采集疑似鸡毒霉形体 (MG)感染的 46份病鸡病料中分离到 7个菌株 ,经分离培养、L形细菌检验、理化特性鉴定、血清学定型、人工感染试验以及PCR扩增检测等方法鉴定 ,确定 7个分离株为MG。     

鸡病毒性关节炎病毒的分离与鉴定

将疑似病毒性关节炎病鸡关节炎炎性渗出物处理之后，在ＳＰＦ鸡胚上传代，第６代时鸡胚开始死亡，第９代以后呈现规律死亡，胚体出血，绒毛膜水肿。以此尿囊液接种Ｖｅｒｏ细胞出现明显的合胞体病变，继而产生严重的细胞脱落。电镜观察，病毒粒子呈六角形，无囊膜，直径约７０ｎｍ。琼扩试验中，该病毒与关节炎病毒特异抗血清呈明显阳性反应。回归试验中，该病毒能使１日龄ＳＰＦ鸡雏在７２ｈ内发生严重的关节炎病变，最终全部死亡。理化特性鉴定证明其核酸为ＲＮＡ，能抵抗乙醚和氯仿。结果表明该分离物为鸡病毒性关节炎病毒。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒JH9801株的分离鉴定

从天津市某肉用鸡场疑似肾型传染性支气管炎(NIB)病鸡中取肾组织,按常规处理后接种9-10日龄鸡胚,连续传代培养至第7代,并对4-7代分离毒株的致病性、血凝性、EID50及对DNV的干扰性和乙醚敏感性进行测试,同时进行了动物回归试验.结果表明,4-7代分离毒株可使85%-90%鸡胚于接种后8-9 d死亡,多数死胚和残存活胚胚体出血、蜷缩、矮化等具有IBV感染特征;该分离毒株无直接血凝性,但经10 g/L胰酶处理后可凝集鸡红细胞;分离毒株对乙醚敏感;动物回归试验中有65%的感染鸡在15 d内发病或死亡.剖检病死鸡可见肾苍白、肿胀,肾小管内充塞大量尿酸盐,外观呈菜花样.经鉴定,分离的病毒株JH9801为鸡肾型传染性支气管炎病毒(NIBV).     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

猪瘟病毒GSLZ株的分离与鉴定

采集甘肃省兰州市某猪场疑似猪瘟样品,将RT-PCR检测为阳性的样品处理后接种PK-15细胞并盲传至第12代,结果在盲传2代之后的细胞培养物中均可检测到猪瘟病毒(CSFV)E2基因.经浓缩、纯化的病毒在电镜下呈约25 nm典型的CSFV病毒粒子,将其命名为GSLZ株.对E2基因核苷酸序列的分析显示,该分离株与标准参考毒株...     

新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定

采用倒置相差显微镜、环境扫描电子显微镜对新生24 h内SD大鼠大脑皮质原代培养的神经元进行了形态学观察,建立了大脑皮质神经元原代培养方法。应用2.5μg/mL阿糖胞苷(Ara-C)对培养3 d的神经元进行24 h干预,去除神经胶质细胞、成纤维细胞、神经干细胞等杂质细胞,以提高神经元产率;用Nissl’s染色法进行神经元鉴定;利用微量滴定(MTT)法测定了一个培养周期(约10 d)的神经元活性分布。光学显微镜观察结果表明,培养至第4 h绝大多数神经元已贴壁生长,胞体上可见1~2个细小突起;培养至第3 d、第6 d时,Nissl’s染色结果显示,加Ara-C能显著提高神经元纯度(≥92%);MTT结合形态学观察结果表明,神经元培养至第6 d时活性最强,细胞呈卵圆形、蜘蛛状、锥体状等多种形态,细胞胞体饱满,光晕明显,神经网络形成完整。     

狐狸奇异变形杆菌的分离与鉴定

无菌采取病死狐狸内脏,用LB液体培养基和麦康凯琼脂平板培养,分离到1株细菌,通过对该菌的形态特征、培养特性、生化特性进行分析,初步鉴定为变形杆菌。用PCR方法扩增该分离菌株的16 SrRNA基因,结果获得大小为1 539 bp的DNA片段(已登录GenBank,登录号EU643833)。经BLAST分析,结果表明,该分离株的16 S rRNA基因核苷酸序列与GenBank上登录的奇异变形杆菌分离株(AY820623、EF091150)的同源性为99.7%,证实该分离菌株为狐狸奇异变形杆菌,并命名为HU/08。致病性试验证明,该分离菌株对小白鼠有高致病性;毒素测定试验证明,该分离菌培养液的无菌滤液对小白鼠无毒性作用。     

辽宁省鸡大肠杆菌病病原分离与鉴定

从辽宁省１３个市（地）收集的４１４份鸡大肠杆菌病料中，分离出３７０株大肠埃希氏菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ），并对其进行了生化试验、致病性试验及血清型的鉴定。在已定型的３０６株中，Ｏ７８型有１２９株，占定型菌株的４２％；Ｏ１型有９６株占３１％；Ｏ２型有３０株，占９．８％；Ｏ５５型有１８株，占５．９％。定型的其它血清型还有Ｏ３５，Ｏ１３８，Ｏ８８，Ｏ６８，Ｏ５，Ｏ１４１，Ｏ８６，Ｏ９９，Ｏ７，Ｏ８，Ｏ７４，Ｏ１１４，Ｏ１６０。未定型菌６４株，占待检菌株的１７％。调查结果表明，辽宁省流行的鸡致病性大肠杆菌以Ｏ７８，Ｏ１，Ｏ２为优势血清型，占待检菌株的６９％，占定型菌株的８３％     

禽呼肠孤病毒鸡源分离株的鉴定与人工感染试验

从临床患病鸡关节病料中分离到一株病毒,在电镜下观察到病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,外衣壳直径约75 nm,内核约50 nm;分离病毒株对酸、热有较强的抵抗力,对乙醚不敏感;病毒感染鸡胚成纤维细胞上能产生以融合细胞为特征的CPE;爪垫接种1日龄雏鸡表现出明显的病毒性关节炎临床症状,并伴有吸收障碍型和坏死型的病理变化;血清中和交叉试验表明,该病毒分离株与国内的2株番鸭源呼肠孤病毒(YH和YB)分离株和国外S1133呈不同程度的交叉反应。通过对分离病毒株进行电镜观察、理化特性试验、病毒感染力测定、致病性试验、血清学试验,可以确定该分离病毒为禽呼肠孤病毒。     

鹧鸪猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定

1999年6月,某饲养场9日龄鹧鸪发生大批死亡,临床表现为不食、呆立、羽毛松乱、腹泻;病理变化主要表现为肝呈土黄色、出血、并有坏死灶.从肝、脾分离出4株猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis),均有较强的致病性.     

新城疫病毒诱导原代鸡胚成纤维细胞自噬的研究

为掌握新城疫病毒(NDV)在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上诱导细胞自噬的特性,用NDV感染CEF后,以电镜观察自噬体形成、GFP-LC3荧光迁移以及Western-blot检测LC3-Ⅰ/Ⅱ转化判定自噬。p62降解和GFP-LC3向溶酶体的转移判定自噬流。结果显示,在感染后第12~24小时能在细胞中发现大量双层或单层膜结构;转染的GFP-LC3质粒在病毒感染后呈现显著的点状分布,尤其在NDV感染形成的合胞体中明显;且病毒感染后期发生明显的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。NDV感染能够诱导p62蛋白的降解,共聚焦结果显示,GFP-LC3在病毒感染中后期发生向溶酶体的转移,说明NDV感染能够诱导完整自噬流的产生。结果表明,NDV感染CEF后能够强烈诱导细胞自噬发生,这为进一步研究新城疫病毒和禽源细胞互作奠定了基础。     

猪源新城疫病毒的分离鉴定

从发生呼吸道症状的病猪鼻腔中分离到 1株病毒 ,经电镜观察、血凝和血凝抑制试验 ,确定为新城疫病毒。经对鸡胚平均致死时间、鸡胚半数致死量、对鸭胚和鸡、鸭的致死性测定及荧光PCR检测 ,证明分离毒为温和型毒株。     

土壤中食线虫真菌的分离与鉴定

采用线虫诱导培养方法,自甘肃、青海、新疆、陕西、河南等五省(区)采集的234份土壤样品中分离获得了食线虫真菌23株,形态学分类研究表明,它们分属于9属22个种(包括:节丛孢属9个种、隔指孢属2个种、单顶孢属4个种、镰刀菌属2个种、钩丝孢属2个种、轮枝孢属1个种、被孢霉属1个种和茎点霉属1个种)和1株未定种。本研究为开展家畜线虫病的生物防治研究奠定了基础。     

鸡源唾液乳杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为筛选出对禽沙门菌具有显著拮抗效应的益生菌,从健康肉鸡消化道分离菌株,经细菌形态观察、生化试验鉴定及16SrDNA基因序列分析,共鉴定出14株唾液乳杆菌.体外琼脂扩散试验结果显示,WLS001、WLS002、WLS003、WLS004这4株分离株分别对鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌具有明显抑制作用...     

奶牛分枝杆菌的分离鉴定与耐药性分析

为优化分枝杆菌PCR诊断方法并监测牛分枝杆菌耐药性,本研究采用罗氏培养基自奶牛淋巴结和肺中分离分枝杆菌,优化本课题组建立的两级多重PCR方法用于分离菌株的分子诊断。一级PCR为两重PCR,靶标16SrRNA进行属和群的鉴定;二级PCR为七重PCR,根据结核分枝杆菌复合群(Mycobacte-rium tuberculosis complex,MTBC)成员染色体缺失区域的差异,设计了7对引物,依据群内不同种各自呈现特定的扩增谱型进行种的鉴定。对MTBC分离株,全菌水平用绝对浓度法对4种抗结核一线药物(RFP、INH、EMB、SM)进行药敏试验;分子水平用PCR扩增耐药基因rpoB、katG、inhA、embB、rrs,并测序分析。结果显示,本试验共分离出14株分枝杆菌,一级PCR鉴定均为分枝杆菌属成员,其中8株为MTBC成员。二级PCR中,这8株均呈现相同的扩增谱型,均为牛分枝杆菌谱型。药敏试验和耐药基因检测结果一致,8株牛分枝杆菌分离株对4种抗结核病一线药物全部敏感,基因序列分析未见突变。结果表明,本研究优化的两级多重PCR方法具有快速可靠和低成本的优势,是目前国内最新的分子诊断方法。     

广西玉林地区MDV强毒YL2002株的分离鉴定

广西玉林地区鸡马立克氏病(MD)疫苗免疫鸡群出现MD疫情,笔者从出现MD疫情的规模化肉鸡养殖场采集抗凝血,分离得到MDV野毒株,鉴定为血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV),命名为YL2002.与15株参考毒株进行比对,meq基因核苷酸同源性分析结果显示,YL2002株与JS201801株MDV同源性最高,为100％;与64...     

空肠弯杆菌的分离与鉴定的研究

本文报道了从奶牛、产蛋鸡、屠宰场的猪、舍饲的绵羊和山羊的粪便及肠内容物分离空肠弯杆菌的试验结果。从肠内容物取样,猪分离率为32.61％;粪便材料,猪、鸡、奶牛、山羊和绵羊分别为26.47％,13.04％,9.76％,13.33％和6.82％。利用改良的布氏半固体培养基,接种新分离株后置37℃保存,解决了弯杆菌新分离株保存难题。5株新分离株分别于10、20、30和40天检查,全部存活,效果可靠。这一方法对分离鉴定弯杆菌时菌株的短期保存,具有实际的应用价值。