胎羊与成年绵羊原代肝细胞的分离培养与鉴定

为了获得稳定、可持续传代的绵羊肝细胞,采集110～120 d的绵羊胚胎肝和正常未怀孕成年绵羊肝,用胶原酶两步灌流法分离肝细胞;用PAS染色法和CK-18免疫荧光法鉴定细胞;用CCK-8测定肝细胞第6、12、24、36、48、60、72和96小时的D_(450)值,绘制生长曲线。结果显示,获得的绵羊原代肝细胞形态完整,贴壁良好,平均存活率为92%。PAS和CK-18荧光染色呈阳性,肝细胞纯度在95%以上。胎羊原代肝细胞可传代,成年绵羊肝细胞不可传代。由以上结果可知,将经典的Seglen两步原位胶原酶灌流法进行优化改良,可获得大量高纯度、高活性的绵羊原代肝细胞,胎羊肝细胞具有良好的活性,可满足需要大量肝细胞的体外试验研究。     

鸡传染性贫血病毒的分离鉴定

在山东省从死亡率达７２％、混合感染多种病原微生物的海兰白蛋鸡和艾维茵肉鸡群中分离到３株鸡贫血病毒（ＣＡＶ），这些毒株耐体积分数５０％氯仿和７０℃水浴１５ｍｉｎ，能在ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞内增殖。用分离的细胞毒接种１日龄ＳＰＦ鸡呈现典型的鸡传染性贫血特征性的临床症状和病理变化；用间接免疫荧光检查感染的ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞涂片和鸡组织触片，可见特异的核内荧光。分离毒株能被ＣＡＶ－ＴＫ５８０３株抗血清所中和；５周龄ＳＰＦ鸡接种分离细胞毒可产生ＣＡＶ抗体；电子显微镜观察，分离毒株ＭＳＢ１细胞培养物中有大量２０ｎｍ左右的病毒粒子。应用特异性ＰＣＲ引物可扩增到预计长度的病毒核酸片段，进一步证实分离株为ＣＡＶ。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)Van Roekel株作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法(IFA)和免疫组织化学法鉴定,经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2,制备了腹水,并利用该单克隆抗体初步建立了Dot-ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。     

铜离子在诱导鸡原代肝细胞凋亡方面及其对Drp1基因表达水平的影响

为了研究铜离子(Cu2+)在诱导鸡原代肝细胞凋亡方面及其对Drp1(dynamin-related protein 1)基因表达的影响,在无菌条件下采集13日龄SPF鸡胚肝脏,剪碎后用胶原酶消化成单个细胞,采用无血清培养法培养,在细胞对数生长期分别用终浓度为200、100和10 mol/L的Cu2+孵育细胞24 h,采用DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧(ROS)的含量,采用JC-1线粒体膜电位法检测细胞凋亡,采用RT-q PCR测定Drp1基因的表达情况。结果显示,与对照组相比,200和100 mol/L Cu2+组鸡原代肝细胞凋亡数目显著增加,ROS含量显著上升且Drp1基因表达显著升高(P0.05),10 mol/L Cu2+组鸡原代肝细胞则无论ROS含量还是Drp1基因的表达均无显著差异。结果表明,髙浓度Cu2+(200和100 mol/L)通过生成大量ROS引发鸡原代肝细胞凋亡,同时使得Drp1基因表达升高,提示Drp1基因可能参与调控鸡原代肝细胞凋亡。     

高铜对鸡肝细胞NFκB及相关细胞因子mRNA表达的影响

为了探讨高铜(Cu)对鸡肝细胞NFκB信号分子及细胞因子mRNA表达的影响,本试验分为体内和体外两个部分进行。体内试验选取1日龄健康白羽肉鸡48羽,随机分为4组,每组12羽,并分别饲喂对照日粮(Cu 11 mg/kg,对照组)和高铜日粮(Cu 110 mg/kg,高铜Ⅰ组;Cu 220 mg/kg,高铜Ⅱ组;Cu 330mg/kg,高铜Ⅲ组),于49日龄采集肝,制作组织切片观察肝病理变化,并采用实时荧光定量PCR方法检测NFκB信号通路中相关细胞因子(NFκB、TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6和iNOS)的mRNA转录水平。体外试验以不同浓度的硫酸铜(0、10、50、100umol/L)处理鸡胚原代肝细胞24 h,普通光学显微镜观察肝细胞形态,实时荧光定量PCR检测上述基因的mRNA转录水平,并使用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)与硫酸铜共同作用于肝细胞后检测上述指标的变化。体内与体外试验结果显示,高铜可致鸡肝细胞损伤,同时诱导NFκB、TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、iNOS的mRNA表达显著上调。与硫酸铜单独作用相比,NAC与硫酸铜联合作用可缓解肝细胞的损伤,上述基因的mRNA转录水平也显著下调。结果表明,高铜可激活并调节NFκB及相关细胞因子mRNA的表达。     

仔猪胰腺干细胞的多向分化潜能

以分离自1日龄仔猪体内的胰腺干细胞为检测细胞,诱导其向胰腺β细胞和三胚层功能性细胞分化,以证实分离的胰腺干细胞具有多向分化潜能。采用RPMI 1640培养液添加烟碱和肝细胞生长因子诱导胰腺干细胞向β细胞分化;添加5-氮胞苷向心肌细胞诱导;用地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸盐联合向成骨细胞诱导;用不同浓度的β-巯基乙醇作用不同时间向神经细胞诱导。结果表明,分离的仔猪胰腺干细胞在向胰腺β细胞诱导后,表现出胰岛素特征性双硫腙染色阳性,不同浓度的葡萄糖刺激诱导胰腺干细胞可分泌一定量的胰岛素;向心肌细胞诱导后,表现心肌细胞的α-actin和肌糖原阳性;向成骨细胞诱导后,细胞表现成骨细胞的碱性磷酸酶阳性和基质细胞钙离子茜素红染色阳性;向神经细胞诱导后,表达神经细胞的神经胶质纤维酸性蛋白、髓磷脂碱性蛋白、神经丝蛋白-200等多种表面标志。证实分离的仔猪胰腺干细胞具有向三胚层功能性细胞分化的多向分化潜能。     

三株腺胃型传染性支气管炎病毒分离毒株对鸡的致病性试验

为探明腺胃型传染性支气管炎病毒(IBV)对鸡的致病性,采用滴鼻、点眼和滴口方法,用QXIBV、DYIBV、FCIBV分离毒株对未免疫鸡和SPF鸡进行了攻毒致病回归试验。结果显示,未免疫的10日龄鸡攻毒后致死鸡的剖检变化与20日龄未免疫的被攻毒鸡相似,均有腺胃肿大,腺胃黏膜出血、溃疡,肾肿大、尿酸盐沉积等病变;20日龄(高日龄)攻毒鸡较低日龄(10日龄)攻毒鸡死亡率偏高。被攻毒的SPF鸡均出现精神沉郁、羽毛蓬乱、腹泻等与自然发病鸡相同的临床症状和病理变化(腺胃肿大,黏膜出血、溃疡,肾肿大、尿酸盐沉积等病变);被攻毒的未免疫鸡、SPF鸡与自然发病鸡死亡率相似。试验结果表明,用这3株腺胃型IBV分离株均能人工复制出与自然发病鸡基本一致的临床症状和病理变化。     

绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

诱导型腹水综合征肉鸡心肌的病理变化与增殖

为探索诱导型腹水综合征肉鸡心脏的病理变化与心肌细胞增殖之间的关系,将20日龄白羽肉鸡分成对照组(静脉注射肝素钠生理盐水,n=30)和试验组(静脉注射含纤维素微粒的肝素钠生理盐水,n=90)。自注射纤维素微粒后,记录腹水综合征(AS)发病率,并于肉鸡42日龄时取样,测定右心室重量与全心室重量之比(mrv/mtv)、红细胞压积(PCV)以及血清中谷草转氨酶(AST)活性浓度和肌酸激酶(CK)活性浓度;右心室组织常规苏木精—伊红染色,并运用实时荧光定量PCR测定右心室组织PCNA和Ki-67的表达量。结果,与对照组相比,试验组肉鸡AS发病率、mrv/mtv值、PCV及血清中AST活性浓度和CK活性浓度显著增高(P0.01);试验组肉鸡的右心室明显扩张,心肌细胞出现水肿现象,但PCNA和Ki-67的m RNA表达量无明显变化。上述结果表明,诱导型腹水综合征肉鸡心脏产生了严重的病理变化,但心肌所产生的这种病变与细胞的增殖无关。     

柔嫩艾美耳球虫感染鸡的盲肠上皮间淋巴细胞表达白介素17的动态变化

以1×104个柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊感染10日龄AA肉鸡,于感染后第24、48及72小时分离鸡盲肠上皮间淋巴细胞(IELs)。提取鸡盲肠IELs总RNA,用实时荧光定量PCR方法检测IL-17的表达动态;然后用FITC标记的抗鸡CD4单抗和PE标记的抗小鼠IL-17单抗作为抗体对盲肠IELs进行荧光抗体染色,再进行流式细胞术分析,检测了表达IL-17的CD4+盲肠IELs在柔嫩艾美耳球虫感染后的动态变化。实时荧光定量PCR结果表明,鸡在感染柔嫩艾美耳球虫后能够显著上调IL-17mR-NA的表达水平,流式细胞分析结果表明,在球虫感染后表达IL-17的CD4+细胞数量显著上升。这些结果表明,IL-17参与了宿主抵抗球虫感染的反应。     

硝基苯对小鼠肝微粒体混合功能氧化酶活性的影响

采用灌胃的方法对试验小鼠进行硝基苯(NB)染毒,染毒剂量分别为26 mg/kg、52 mg/kg、105mg/kg,每天染毒1次,共30 d,观察小鼠肝显微及超微结构的变化,并检测了肝微粒体混合功能氧化酶活性.结果显示,主要表现为光镜下肝细胞水变性,电镜下线粒体肿胀,脊断裂;内质网脱核糖颗粒;细胞核发生形变;次级溶酶体、脂滴数量增多,糖原颗粒减少等一系列的病理学变化.随着染毒剂量的加大,肝微粒体混合功能氧化酶中的细胞色素P450的含量呈波动性变化;细胞色素b5和EROD酶的活性逐渐升高;NAD-PH细胞色素C还原酶的活性逐渐降低.表明NB对小鼠肝毒性作用随染毒剂量的增加而加强;EROD可以作为检测环境中NB污染水平的生物标志物.     

绵羊痘病毒固原株的分离与鉴定

取发病绵羊的皮肤痘疹研磨制成病料样品悬液,将该悬液感染未免疫的健康绵羊,同时接种原代绵羊羔羊睾丸(LT)细胞,盲传5代后,转接Vero细胞,进行间接免疫荧光试验和PCR鉴定。样品悬液感染未免疫的健康绵羊后出现绵羊痘的典型发病症状,经过LT细胞传代后转接Vero细胞,出现了特征性细胞病变;间接免疫荧光试验和PCR均检测出病毒存在。PCR产物的核酸序列测定结果显示,分离毒株的RPO30基因与已发表的绵羊痘病毒毒株的相应基因的同源性在99%以上。上述结果表明,本研究从宁夏固原市疑似绵羊痘病毒感染的绵羊体内成功分离到1株绵羊痘病毒,并将其命名为绵羊痘病毒固原株。     

非解乳糖链球菌FGM对大肠杆菌感染肉鸡肠道健康的影响

本试验旨在研究非解乳糖链球菌FGM对大肠杆菌感染肉鸡肠道健康的影响。选用150只1日龄白羽肉鸡,随机分为3组,每组50只,试验期21 d,饲喂基础日粮。1~10日龄时,空白对照组(BG)和模型组(EG)每只鸡每日灌服0.2 mL的生理盐水,非解乳糖链球菌(FGM)组每只鸡每日灌服0.2 mL浓度为1×10^9 CFU/mL的FGM菌液。FGM组和EG组鸡于14日龄时,灌服1次0.2 mL浓度为6×10^8 CFU/mL大肠杆菌O78菌液。分别于攻毒后第0、1、3和7天,观察各试验组鸡十二指肠肠绒毛结构,检测十二指肠sIgA含量、MPO、GSH-PX和SOD活力及T-AOC含量。结果显示,FGM组鸡十二指肠肠绒毛较EG组完整,MPO活力显著低于EG组(P<0.05),sIgA含量显著高于EG组(P<0.05),GSH-PX和SOD活力与T-AOC含量高于EG组。结果提示,分离于鸡盲肠的非解乳糖链球菌可通过保护肠绒毛结构、调节肠道免疫力与抗氧化能力,增强鸡抗感染力,发挥保护肠道健康的效果。     

重组鸡γ干扰素对柔嫩艾美球虫卵囊免疫鸡肠道免疫相关细胞数量的影响

分别给7日龄和14日龄雏鸡免疫柔嫩艾美球虫孢子化卵囊并同时肌肉注射5 000 U重组鸡γ干扰素(rChIFN-γ),21日龄再以5×104个同源柔嫩艾美球虫孢子化卵囊攻虫.分别取试验鸡各肠段制作组织切片,经HE和PAS染色后显微镜检查.发现21日龄时,rChIFN-γ加强免疫组鸡肠道黏膜上皮内淋巴细胞(IELs,9.8)和杯状细胞(GCs,26.2)数量显著高于免疫对照组(8.2、24.9);28日龄时,加强免疫组的IELs和GCs数量进一步增多(13.5、34.1)并显著高于免疫对照组(11.8、26.9).用改良甲苯胺蓝组织化学染色法检测发现,rhIFN-γ可增加十二指肠、空肠、回肠和盲肠黏膜上皮肥大细胞(MCs)数量.结果提示,rChIFN-γ可有效刺激试验鸡肠道黏膜IELs、GCs和MCs的分化与增殖,具有增强肠道黏膜非特异性免疫的作用.     

应用荧光抗体技术诊断鸡新城疫

1983年4月,在陕西某养鸡场,经Ⅱ系苗饮水免疫和未经免疫的雏鸡群中大批鸡只发病死亡。经免疫荧光法检验和病原分离诊断,确定为鸡新城疫强毒所感染。下述诊断过程。 (一)疫病流行情况及临床表现 疫病开始在一个鸡舍发生,经10天后波及至三个鸡舍,日死亡最高达3798只,19天内共死亡雏鸡24276只,给该场雏鸡生产造成极大经济损失。发病鸡中多数为经过新城疫Ⅱ系苗饮水免疫的1、2、4月龄雏鸡,另外一群未来得及免疫的10日龄左右雏鸡发病和死亡率更高,而该场成年鸡未见发病。发病初期,为最急性型,常见不到任何临床症状,突然发病大批死亡,进而可发现鸡群中部分鸡只精神委靡,羽毛蓬乱,翅尾下垂和呼吸困难等症状。病程较长的患鸡可见到拉稀,粪便带血,也有少数病鸡出现头颈歪斜,作转圈运动的神经症状。     

感染传染性法氏囊病病毒的DF-1细胞中chTLR3表达的动态变化

为研究鸡Toll样受体3(chTLR3)基因在传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染DF-1细胞过程中的表达情况,用3种不同毒力的IBDV感染DF-1细胞,采用实时荧光定量PCR法以及间接免疫荧光法对细胞内chTLR3基因的表达情况进行了检测。结果显示,DF-1细胞感染IBDV标准株后,其chTLR3mRNA的表达量呈增长趋势,感染后第48小时mRNA表达量达到峰值(P0.01),之后逐渐下降;DF-1细胞分别感染IBDV弱毒疫苗株与分离株后,其chTLR3mRNA表达量均出现先上升后下降的趋势,但其表达量低于标准株(P0.01)。采用间接免疫荧光法检测的chTLR3蛋白的表达变化规律与其基因的表达变化规律相同。结果证实,chTLR3参与IBDV感染DF-1细胞的过程;IBDV的毒力可影响chTLR3的表达。     

鸡体内鹅源新城疫病毒抗原的免疫组织化学检测

为研究鹅新城疫(ND)的发病机理,用3株鹅新城疫病毒强毒株分别人工感染25日龄雏鸡,以单克隆抗体介导的免疫组化(IHC)法检测攻毒鸡体内NDV抗原的分布及定位,研究了鹅新城疫病毒(NDV)对鸡的组织嗜性.结果显示,在试验鸡多种组织器官中均能检测到NDV抗原,病毒抗原主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞、肝细胞及各种上皮细胞的胞浆内.结果表明,鹅NDV强毒株对鸡是一种泛嗜性病毒.     

鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及其致病性的研究

本研究从江苏省某鸡场疑似鸡传染性支气管炎(IB)的病料中,利用SPF鸡胚尿囊腔接种的方法分离出1株传染性支气管炎病毒(IBV),命名为CK/CH/JS/TZHY48。经RT-PCR检测,该株IBV的S1基因全长1 638 bp。遗传进化分析显示,分离株属于基因Ⅵ型,与常规疫苗株H120和H52的同源性较远。分离株对鸡胚有明显的致矮小化作用;对新城疫病毒有显著的干扰作用。动物回归试验结果显示,该分离株对7日龄SPF鸡的发病率为100%,致死率为40%,发病鸡出现气管啰音,甩头流鼻涕等呼吸道症状;病死鸡的剖检病理变化主要表现为肾苍白肿大,花斑肾,有大量明显的白色尿酸盐沉积,气管环出血。本研究可为IBV的遗传进化、致病机制以及免疫防控提供参考。     

应用免疫荧光法检测鸡血T、B淋巴细胞值

鸡体的免疫状况与免疫器官及血液中T、B淋巴细胞密切相关。因此,可通过测定血液中淋巴细胞数量的变化,了解鸡的免疫状态。我们试用兔抗鸡胸腺及抗腔上囊血清作为特异性抗体,以羊抗兔荧光抗体作为第二抗体,检测了不同日龄鸡血液中T、B淋巴细胞数量的正常值。介绍如下。 (一)材料和方法 1.抗腔上囊及抗胸腺血清的制备:取25～30日龄来航鸡的腔上囊及胸腺,除去被膜和脂肪,用汉克氏液冲洗后,在有汉克氏液的培养皿中充分剪碎,过滤,滤液用Ficoll—Hv—     

重组鸡痘病毒rFPV-VP3-F的遗传稳定性及在鸡体内的表达

为了评价重组禽痘病毒rFPV-VP3-F的遗传稳定性,将rFPV-VP3-F在鸡胚成纤维细胞(CEF)连续培养20代.对第5、10、15和20代病毒的F基因进行扩增及序列分析,未发现F基因发生氨基酸改变;通过间接免疫荧光方法检测各个代次rFPV-VP3-F中F基因特异表达的情况;将rFPV-VP3-F和禽痘病毒FPV017分别接种于35日龄商品鸡,在免疫后第7、14、21、28、35 d采集各组血清,检测中和抗体效价.结果显示,F基因在重组禽痘病毒中可以稳定遗传,可在CEF中表达相应蛋白,可刺激鸡产生相应的抗体.