牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒及牛支原体三重Nano-PCR方法的建立与初步应用

为了同时检测临床上牛常见的三种呼吸道重要病原体,本研究针对牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）和牛支原体（MB）保守基因进行引物设计,并成功构建标准阳性质粒。使用纳米金颗粒将普通PCR方法优化,建立了三重Nano-PCR检测方法。结果显示,三重Nano-PCR检测方法可同时检测出BVDV、IBRV和MB的阳性质粒（1μL）最低检测分别为1 fg、100 ag、10 fg,灵敏度分别为常规PCR的10、10、100倍。临床结果显示,30份采集于临床呼吸道病牛样品中,BVDV、IBRV和MB的Nano-PCR的检测阳性率分别为33.33%、36.67%、33.33%,而普通PCR的检测阳性率分别为26.67%、30%、20%,提示BVDV和IBRV混合感染最多,阳性率可达26.67%。三重Nano-PCR方法特异性良好,检测其他牛呼吸道相关病原体BCV、BPIV3和BRV时结果均呈阴性。本研究建立的快速灵敏且特异良好的三重Nano-PCR检测方法可广泛应用于临床诊断和流行病学筛查。     

牛病毒性腹泻病毒Nano-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的分子检测方法,本研究利用金纳米颗粒材料与传统PCR技术相结合,针对BVDV 5′UTR保守序列设计引物,建立了BVDV Nano-PCR新型分子检测方法,并与RT-PCR及商品化IDEXX试剂盒BVDV抗原检测方法分别对临床样品进行对比研究。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR只对BVDV特异,而对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感3型病毒(BPIV3)均无交叉反应;Nano-PCR敏感性是普通PCR的10倍,最低核酸检测量为6.84×10~2copies/L。临床检测结果显示,建立的Nano-PCR方法对38份临床样品的阳性检出率为34.21%,是RT-PCR的2.6倍,是IDEXX试剂盒的1.5倍。本研究结果表明,建立的BVDV Nano-PCR方法可以用来对临床样品进行快速诊断和鉴定,具有特异性高、灵敏度好、快速稳定的优点。     

牛诺如病毒和牛嵴病毒及牛环曲病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为了解牛诺如病毒(BNo V)、牛嵴病毒(BKV)和牛环曲病毒(BTo V)在国内的流行情况,本研究参考Gen Bank中登录的BNo V Rd Rp基因、BKV 3D基因和BTo V N基因保守区域,设计3对特异性引物,成功建立了能够同时快速检测BNo V、BKV、BTo V的三重RT-PCR方法。该方法特异性较强,仅对BNo V、BKV、BTo V扩增出特异性条带,对其他5种常见引发犊牛腹泻的病毒均未扩增出条带;敏感性较高,针对p MD18-T-BNo V、p MD18-T-BKV和p MD18-T-BTo V质粒标准品的最低检测限分别为2.73×10⁴ copies/μL、2.87×10⁴copies/μL、3.18×10³copies/μL;重复性好,同批次样品的3次检测结果均一致。使用该方法对153份临床样品进行检测,结果显示,BNo V、BKV、BTo V的阳性率分别为11.11%、25.49%、38.56%,3种病毒混合感染率为7.18%。与其他学者建立的单一RT-PCR检测方法相比,符合率分别为94.77...     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒3型的双重荧光PCR方法的建立及应用

为建立同时检测牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）和牛副流感病毒3型（BPIV3）的方法,通过对引物和探针筛选、反应体系和条件优化,成功建立了检测IBRV和BPIV3的双重荧光定量PCR方法。该方法只能特异性地检出IBRV和BPIV3,而对其他无关病原均不能检出;批内和批间变异系数均小于3%;对IBRV和BPIV3质粒标准品的检测下限分别为15.2 copies/μL和18.3 copies/μL。用建立的方法对采自四川、重庆、河北、安徽和吉林这5个地区的143份肉牛呼吸道疾病综合征(BRDC)样本以及四川省和青海省的59份牦牛BRDC样本进行检测,结果显示,肉牛样本中IBRV和BPIV3的阳性率分别为42.66%和39.86%,混感率为22.38%;牦牛样本中IBRV和BPIV3的阳性率分别为44.07%和30.51%,混感率为18.64%。上述结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有特异性和稳定性好、灵敏度高的特点,适用于临床上对IBRV和BPIV3的快速检测,临床样本的检测结果丰富了国内IBRV和BPIV3的流行病学资料。     

牛支原体牛多杀性巴氏杆菌与牛传染性鼻气管炎病毒三重PCR方法的建立与初步应用

为建立一种可同时检测牛支原体(MB)、多杀性巴氏杆菌(PM)与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的三重PCR检测方法,笔者设计1对特异性引物,引用文献的2对引物,对反应条件与反应体系进行优化,建立了一种三重PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果显示,最佳退火温度为51.7℃,最佳引物终浓度均为0.5μmol/L;敏感性结果显示,MB、PM、IBRV的最低检出限分别为3.9×10^-3ng/μL、6.61×10^-2ng/μL与2.97×10^-2ng/μL;特异性结果显示该方法只能特异性检测出MB、PM和IBRV。利用建立的三重PCR方法对108份临床病料进行检测,结果与单一PCR一致。结果表明,该方法可用于临床快速检测MB、PM、IBRV。     

牛冠状病毒牛肠病毒牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法的建立与应用

为建立一种可以快速检测牛冠状病毒（BCoV）、牛肠病毒（BEV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光PCR方法并应用于临床检测,根据BCoV N基因、BEV 5′-UTR基因、BVDV 5′-UTR基因设计3对特异性引物和探针,通过对引物、探针的浓度以及反应条件的优化,建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法,并对该三重PCR方法的敏感性、重复性、特异性和临床样本检测结果进行了评价。结果显示,该方法灵敏度高,对BCoV、BEV和BVDV的最低检测限为10 copies/μL;重复性稳定,批内和批间变异系数（CV）均在2%以下;特异性强,对常见腹泻类病原无交叉反应。应用此方法检测河南省445份牛腹泻粪便样本,BCoV、BEV和BVDV的阳性率分别为6.5%(29/445)、17.5%(78/445)、12.1%(54/445)。上述结果表明,本研究建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒一步法三重实时荧光PCR方法,为疫病的快速检测及预防提供了有效的技术手段。     

检测牛传染性鼻气管炎病毒和牛支原体的双重PCR方法的建立及应用

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的常见病原,临床上多见混合感染。本试验的目的是建立同时检测IBRV和M.bovis的双重PCR方法。通过设计引物、优化反应体系及条件,成功建立了同时检测IBRV和M.bovis的双重PCR方法。该方法具有良好的特异性和稳定性,且对IBRV和牛支原体的检测下限分别为2.03×104copies/L和1.65×104copies/L,灵敏度较好。利用该方法对四川省7个肉牛养殖场67份疑似BRDC样本进行检测,结果显示,IBRV和M.bovis阳性率分别为46.27%和32.84%,其中IBRV和M.bovis混合感染率为19.40%,表明四川省肉牛养殖场IBRV和M.bovis感染情况较普遍。     

牛病毒性腹泻病毒可视化一步RT-LAMP检测方法的建立

为建立可视化一步RT-LAMP检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,根据GenBank中的BVDV的5′UTR序列,设计2组RT-LAMP引物,经过反应温度、反应时间、Mg²⁺和甜菜碱的终浓度的优化,特异性及灵敏性试验,对3种常用显色指示剂钙黄绿素-MnCl₂、羟基萘酚蓝和中性红的显色效果进行评估,并使用商品化ELISA试剂盒与本方法进行对照试验。结果显示,经优化本方法在66℃30 min即可完成反应,采用中性红作为显色指示剂,检测BVDV可产生特异阳性反应;对BVDV RNA检测下限最低达0.021 pg/μL;对13份临床样品检测结果与商品化ELISA检测试剂盒相符率100%。结果表明,所建立的BVDV可视化一步RT-LAMP检测方法的特异性、灵敏性较好,可为BVDV临床快速检测提供帮助。     

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

牛病毒性腹泻病毒荧光标记单克隆抗体的制备及鉴定

为制备可以区分牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因型的荧光标记单克隆抗体,分别利用分泌抗牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒(BVDV-Ⅰ)、牛病毒性腹泻Ⅱ型病毒(BVDV-Ⅱ)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ)单克隆抗体的杂交瘤细胞株BV1、BV2、BV12,腹腔接种BALB/c小鼠,大量制备单克隆抗体,用辛酸-硫酸铵法提纯,经活性、浓度、纯度检测合格后,利用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联,制备成3种荧光标记单抗。结果显示,3种标记单抗的F/P比值范围均在2.0～4.0之间;细胞DFA法测定其效价均≥1∶200;抗原交叉试验证实标记单抗的特异性良好;标记单抗可以检测到1TCID50的病毒粒子;临床初步应用表明,3种标记单抗的阳性检出率均≥95%,与进口BVDV荧光抗体的符合率为100%。3种荧光抗体的研制对BVDV基因分型鉴定、NCP型BVDV的鉴定以及BVDV与CSFV的鉴别诊断有很好的应用价值,值得进一步开发。     

牛传染性鼻气管炎间接ELISA诊断方法的建立

以牛肾细胞系(MDBK)培养牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)Bartha Nu/67株,经超速离心纯化病毒,再经超声破碎处理后作为诊断抗原,建立了检测牛血清IBRV抗体的间接酶联免疫吸附试验。该ELISA的判定标准为:血清D490 nm值大于0.369的判为阳性,小于0.295的判为阴性,在0.295与0.369之间的为可疑。特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性高、重复性好。与法国进口ELISA抗体诊断试剂盒比较,其符合率为96.3%;与中和试验比较,符合率为95.8%,且敏感性更高。应用该诊断方法调查了我国部分地区IBRV的感染情况,结果显示,这些地区的IBRV感染率为67.1%。     

水禽3种免疫抑制性病毒多重PCR检测方法的建立与应用

禽流感病毒 H9 亚型(AIV-H9)、鹅圆环病毒(GoCV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)是水禽常见病原,常发生混合感染且易导致水禽的免疫抑制性疾病。 本研究针对 AIV-H9、GoCV 和 MDRV 的基因序列,分别设计特异性引物,通过优化多重 PCR 的反应条件,建立了这 3 种病毒的多重 PCR 检测方法,并进行特异性、灵敏度和可重复性验证。 结果显示,建立的三重 PCR 检测方法能特异性扩增 AIV-H9、GoCV 和 MDRV的目的片段,与新型鹅星状病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽腺病毒 4 型无交叉反应;最低检出浓度分别为2.93×10⁴copies/ μL、2.5×10²copies/ μL、3.0×10⁶copies/ μL;利用该方法对 30 份临床样品进行检测,MDRV检出率为 6.7%,GoCV 和 AIV-H9 的检出率较高,分别为 36.7%和 26.7%。 三重 PCR 与单重 PCR 的符合率为 100%。 结果表明,该三重 PCR 检测方法特异、灵敏、稳定性好,能够用于这 3 种病毒的流行病...     

猪乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×10¹～7.2×10⁸ copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×10⁰copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。     

黑龙江省部分奶牛场牛病毒性腹泻病毒感染的血清学调查

为了解黑龙江省奶牛场牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染情况,采用已建立的BVDV NS3蛋白抗体间接ELISA方法对采自黑龙江省内不同地区的4个奶牛养殖场2006～2008年的1388份血清样本进行了BVDV抗体检测.结果显示,4个奶牛养殖场这3年的平均BVDV血清阳性率分别为54.66%、57.68%和62.90%.提示,在黑龙江省奶牛养殖场中BVDV感染率较高,并且呈逐年上升趋势.     

表达马尔堡病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建

为了构建携带e GFP标签并表达马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)囊膜糖蛋白(GP)的复制型水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis v,iVrSuVs)假型病毒,通过将VSV感染性克隆全长质粒中的G基因替换成马尔堡病毒的GP基因,与4个辅助质粒p3.1-VSV-N、p3.1-VSV-P、p3.1-VSV-L、p3.1-VSV-G共转染BSR细胞,拯救成功的重组VSV病毒传5代后,进行Western-blot、间接免疫荧光试验、RT-PCR鉴定和生长动力学曲线检测。显微镜检测结果显示,3个重组全长质粒分别与4个辅助质粒共转染BSR细胞培养48 h后均能使细胞发生合胞体病变并伴有绿色荧光蛋白表达;Western-blot、间接免疫荧光试验鉴定结果显示,3株马尔堡病毒的囊膜糖蛋白在重组VSV病毒中正确表达;生长动力学曲线显示,3株重组VSV病毒的毒力相较于母本VSV病毒均降低,但病毒滴度依旧能达到1×10⁶～1×10⁷TCID₅₀mL^-1。结论：本研究成功构建3株携带e ...     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

牛副流感病毒3型TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群临床样本进行了检测。结果显示,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR的最低检测限为17.6copies/μL,同时进行批内、批间5次重复性试验,变异系数均小于2.5%。应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒1型,结果均为阴性,说明建立的方法特异性较强。用建立的方法检测人工感染BPIV3的犊牛鼻拭子样本,检测结果与样本TCID50的测定结果相符合,但比其更敏感。结果表明,本试验中建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR可以作为BPIV3早期诊断及定量分析的有效技术手段。     

猪血清中牛病毒性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

为建立检测猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的ELISA方法,经ELISA反应条件优化、特异性试验、重复性试验及与中和法、IDEXX ELISA对比试验建立了特异性ELISA。用此方法对福州市周边20个猪场的222份猪血样进行了BVDV抗体检测。结果显示,本ELISA反应条件为:BVDV Oregon C24V与NADL株联合包被(质量浓度均为31.25μg/L,每孔加50μL)的条件为37℃1h加4℃8h,家兔抗猪瘟病毒(CSFV)超免疫血清(每孔血清效价可中和400RID CSFV)阻断时间为2.0h,封闭剂和血清稀释液中NaCl的浓度和Tween-20的体积分数分别为0.7mol/L和3.00mL/L,100mL/L马血清封闭剂、1∶50稀释的待检血清、0.625 mg/L HRP-家兔抗猪IgG酶标二抗(100μL/孔)及底物的反应时间分别为2.0、0.5、0.5h及15min;检测CSFV、伪犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均为阴性;4份血样进行5次板内、板间重复试验结果均一致;参照中和试验,本ELISA方法的符合率(97.9%)高于IDEXX BVDV ELISA抗体检测试剂盒(93.8%);福州市周边猪群BVDV抗体阳性率为34.7%,猪场阳性率为80.0%,其中母猪群阳性率(44.6%)高于商品猪群(26.4%)。结果表明,本ELISA方法特异性强、符合率高、重复性好,适合用于猪源BVDV的血清学监测。     

中蜂囊状幼虫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立与应用

通过RT-PCR方法在云南中华蜜蜂体内检测中蜂囊状幼虫病毒(CSBV),该病毒主要以AmSBV-YN(GenBank ID:KX819276.1)病毒株的形式存在。为了精确鉴定、快速检测中蜂囊状幼虫病毒,根据AmSBV-YN的CDS保守区域,设计合成特异性引物并建立相对应的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的标准曲线循环域值(C_t)与标准品模板浓度在2.34×10²～2.34×10⁹copies/μL间的线性关系良好,相关系数R²为0.994,斜率为-3.118。该方法与蜜蜂残翅病毒、黑蜂王台病毒、蜜蜂以色列急性麻痹病毒不发生交叉反应,表明该方法特异性强;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于3%。所建立的荧光定量PCR方法对中华蜜蜂样品的检测结果显示,阳性率达90.0%,高于常规PCR方法的检测阳性率73.3%,说明该方法具有良好的适用性。结果表明,该方法可应用于对中蜂囊状幼虫病毒的快速检测,为中蜂囊状幼虫病的及时防控提供了有力的技术支持。     

鹅星状病毒和鹅坦布苏病毒双重nano-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断鹅星状病毒(GoAstV)和鹅坦布苏病毒(TMUV),本研究根据 GenBank 上公布的GoAstV 和 TMUV 基因保守区设计了 2 对特异性引物,结合金纳米材料,通过对反应条件的优化,建立了一种可同时检测这两种病毒的双重 nano- PCR 诊断方法。 结果显示,该方法对鹅细小病毒(GPV)、鹅圆环病毒(GoCV)、新城疫病毒(NDV)和禽腺病毒(FAdV)这 4 种鹅常见病毒的扩增结果均为阴性。 该方法对 GoAstV和 TMUV 的最低检测浓度分别为 1.21×10¹copies/ μL 和 1.21×10³ copies/ μL,敏感性较普通 PCR 分别高100 倍和 10 倍。 对 42 份临床样品的检测结果显示,共检出 GoAstV 13 份,TMUV 1 份。 上述结果表明,本研究建立的双重 nano- PCR 方法快速、特异、敏感,可用于鹅星状病毒和鹅坦布苏病毒的临床检测和流行病学调查。