水牛匈爱病毒结构蛋白VP1的截短表达及多克隆抗体的制备

为了制备水牛匈爱病毒（BufHuV）结构蛋白VP1截短基因的多克隆抗体,将病毒的VP1截短基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）获得重组质粒pET-32a-BufHuV-VP1,重组质粒转化至BL21感受态细胞（DE3）后诱导表达,VP1截短蛋白的分子质量约为31.5 ku,主要以包涵体的形式表达。以纯化好的重组蛋白免疫昆明小鼠以制备多克隆抗体,通过Western-blot与IFA鉴定其特异性。结果显示,制备的小鼠多克隆抗体能与纯化的VP1重组截短蛋白和感染BufHuV的细胞表达的VP1特异性结合,表明多克隆抗体具有良好的反应原性和特异性。水牛匈爱病毒VP1截短重组蛋白及其多克隆抗体的成功制备为研究BufHuV致病机制、VP1蛋白功能以及血清学检测方法的建立提供了材料基础。     

鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

新型鹅细小病毒VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究造成鸭短喙与侏儒综合征的病原即新型鹅细小病毒（NGPV） VP2蛋白的生物学功能,根据NGPV SD株序列,扩增VP2基因克隆至原核表达载体pET-32a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白。将纯化的蛋白按照标准程序免疫7周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,NGPV VP2基因全长为2 199 bp;通过大肠杆菌BL21(DE3)成功表达出大小约为83 ku的His-VP2融合蛋白。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别VP2蛋白。间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别受感染细胞中的NGPV和鹅细小病毒。综上所述,本研究成功表达并纯化了VP2蛋白,并成功制备了效价高反应性好的多克隆抗体,为进一步探究NGPV VP2蛋白生物学功能奠定了基础。     

鸭肠炎病毒ul47基因的原核表达及其抗血清中和活性的鉴定

提取鸭肠炎病毒(DEV)基因组DNA,采用PCR方法扩增获得了DEVul47基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-30a-ul47,并转化受体菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE分析。结果显示,ul47基因在大肠杆菌Rosetta中获得与预期大小相符的表达蛋白。利用Ni-NTA纯化表达蛋白,制备了兔抗DEV UL47蛋白的多克隆抗体,经琼脂双扩散测定,该抗血清效价为1∶16。间接免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验结果显示,DEV UL47蛋白主要定位于感染细胞的细胞质和细胞膜,制备的兔抗DEV UL47多克隆抗体对DEV有中和活性。     

伪狂犬病病毒gM蛋白多抗的制备及功能探究

为获得免疫原性好的伪狂犬病病毒（PRV）gM蛋白和制备特异性的多克隆抗体,以用于gM蛋白功能的初步研究,本试验截取gM蛋白优势抗原区的碱基序列并插入pET-21a（+）载体,构建原核表达质粒pET-21a-UL10,测序正确后转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。通过尿素法纯化蛋白,将获得的重组蛋白免疫6周龄雌性新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用PRV-UL10真核质粒转染和PRV感染后的细胞样本进行间接免疫荧光、Western-blot和免疫沉淀试验检测其反应性和特异性。使用gM蛋白免疫C57BL/6小鼠后攻毒检测小鼠死亡率。结果显示,成功构建了表达PRV gM蛋白的重组质粒pET-21a-UL10,在37℃诱导6 h后主要以包涵体形式表达;制备的gM蛋白多克隆抗体具有良好的反应性和特异性,可特异性检测到PRV-UL10真核质粒转染和PRV感染细胞中的gM蛋白;小鼠免疫结果显示,gM蛋白诱导的免疫抗体对PRV感染的保护率低。研究表明制备的gM蛋白多克隆抗体具有较好的反应性和特异性,但其对小鼠的保护力较弱,为进一步解析gM蛋白的生物学功能奠定了必要的基础。     

产气荚膜梭菌EF-Tu基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

通过PCR方法扩增产气荚膜梭菌ATCC13124株EF-Tu基因,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-EF,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA、Western-blot和间接免疫荧光方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导5h后蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为69ku。间接ELISA方法检测的多抗血清效价为1∶262 144。Western-blot结果证实,重组蛋白与产气荚膜梭菌ATCC13124株制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的免疫原性。Western-blot和间接免疫荧光结果表明,多抗血清能分别与pGEX-EF重组蛋白、ATCC13124菌体裂解液、pcDNA3.1-EF-Tu瞬时转染后的BHK-21细胞及ATCC13124感染的小鼠肠组织中菌体发生特异性结合反应。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。     

牛结节性皮肤病病毒ORF006蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF006蛋白的生物学功能,制备了ORF006基因的多克隆抗体,用PCR技术获得LSDV ORF006的基因片段克隆至pET-28a原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,LSDV ORF006基因全长约696 bp;pET-28a-ORF006重组质粒在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约28.0 ku目的蛋白;ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶102 400;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别ORF006蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别LSDV感染MDBK细胞表达的ORF006蛋白。本研究为进一步探究LSDV ORF006蛋白生物学功能奠定了基础。     

十二指肠贾第虫γ贾第素基因的原核表达及其表达产物的亚细胞定位

为了对十二指肠贾第虫(简称贾第虫)γ贾第素(γ-giardin)进行原核表达及亚细胞定位,研究其生物学功能,提取贾第虫总RNA,反转录成cDNA,经PCR获得γ-giardin基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a-γ-giardin,再转化入大肠杆菌Rosseta(DE3)后,用IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE验证,并用切胶纯化法纯化。针对重组蛋白制备了多克隆抗体,并用ELISA测定其效价,Western-blot分析其免疫原性,并利用免疫荧光定位技术对γ-giardin进行定位。结果表明,成功构建了原核表达质粒pET-28a-γ-giardin。表达的重组蛋白的分子质量约为38 ku,且以包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白的纯度高达90%以上。ELISA和Western-blot结果显示,γ-giardin抗体具有良好的抗原特异性与优异的抗原结合活性。免疫荧光定位结果表明γ-giardin主要位于贾第虫滋养体的腹吸盘。本研究为今后探讨贾第虫致病机制、临床诊断和治疗奠定了理论基础。     

猪细胞因子信号传导抑制因子1蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备

为制备猪细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的多克隆抗体,采用RT-PCR扩增猪SOCS1基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达载体pET28a-pSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件,并对重组蛋白pSOCS1进行纯化。以表达的重组蛋白pSOCS1免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经4次免疫,间接ELISA测得抗体效价达到1∶51 200。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体可与pSOCS1重组蛋白和经HEK293T细胞过表达的pSOCS1蛋白发生特异性反应,证明pSOCS1重组蛋白免疫原性良好。本研究为后续制备单克隆抗体、研究猪SOCS1相关作用机制奠定了基础。     

肌旋毛虫谷氨酰胺酶基因的原核表达及其免疫荧光定位研究

采用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫中扩增出谷氨酰胺酶(TsGls)基因全长序列,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,测序验证后转化到表达宿主菌Rosetta(DE3)pLysS中,用IPTG诱导表达重组蛋白TsGls。以纯化的TsGls蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对旋毛虫肌幼虫中的TsGls进行免疫荧光定位。结果显示,成功构建了重组质粒pET-32a(+)-TsGls;经SDS-PAGE分析,重组TsGls蛋白的分子质量约为72 ku;制备的多克隆抗体效价可达1.024×10~6;Western-blot分析结果显示,多克隆抗体与重组TsGls具有较强反应性;免疫荧光定位显示,TsGls蛋白存在于旋毛虫肌幼虫皮下组织。上述研究结果为进一步研究旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制奠定了基础。     

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。     

基因Ⅰ型乙脑病毒EDⅢ结构域蛋白的原核表达及其抗体制备与鉴定

为了分析和验证作为乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)亚单位疫苗研制的主要候选抗原EDⅢ结构域的免疫原性及其所产生的抗体对病毒的抑制效果,本研究利用RT-PCR方法扩增基因Ⅰ型JEV GS株EDⅢ结构域基因,构建原核重组表达载体p ET-30a-EDⅢ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,挑取阳性克隆进行诱导表达和纯化;将纯化的EDⅢ重组蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体,利用Western-blot和间接免疫荧光试验验证制备的家兔抗EDⅢ多克隆抗体与全病毒抗原的特异性反应,并通过噬斑减少中和试验(PRNT50)测定家兔抗EDⅢ多克隆抗体的中和抗体效价。结果表明,重组EDⅢ蛋白以包涵体的形式表达,并获得了较高纯度的EDⅢ重组蛋白,制备的家兔抗EDⅢ多克隆抗体与全病毒抗原具有良好的特异性反应,中和抗体效价为133±46.2。以上结果表明,基因Ⅰ型JEV GS株EDⅢ结构域具有良好的免疫原性,免疫动物所产生的抗体具有较高的中和抗体效价,EDⅢ结构域可作为JEV亚单位疫苗研制的候选抗原。     

猪急性腹泻综合征冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)核衣壳(N)蛋白多克隆抗体,采用PCR方法扩增SADS-CoV/CN/GDGL/2017毒株N基因片段,并对N基因的序列以及N蛋白氨基酸突变位点进行分析。随后,将N基因片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)构建重组质粒,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化N蛋白,通过免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。结果表明,扩增的N基因片段和所构建的重组质粒正确无误,成功诱导表达出可溶性重组蛋白SADS-CoV-N,分子质量约为67 ku,最佳诱导时间为6 h。Western-blot以及间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体能特异性检测SADS-CoV,证明重组蛋白有良好的免疫原性。本研究为后续建立SADS-CoV快速诊断方法及该病毒致病机制的深入研究奠定基础。     

重组猪IgGⅡB类Fc受体蛋白的原核表达和抗体的制备

根据GenBank中猪IgGⅡB类Fc受体剪接异构体cDNA(swFcγRⅡB)基因序列(FJ608551),利用Primer5.0软件设计合成了1对特异性引物,扩增swFcγRⅡB去掉胞内区和跨膜区的基因,PCR产物经KpnⅠ+EcoRⅠ双酶切后,将截短的swFcγRⅡB基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-swFcγRⅡB,在IPTG诱导下成功表达了分子质量约为40ku的融合蛋白swFcγRⅡB-His,该表达蛋白在细胞质中主要以不溶性包涵体的形式存在。原核表达蛋白经纯化免疫小鼠,制备鼠源swFcγRⅡB封闭抗体,ELISA检测抗体效价为1:5120,具有高度特异性。Western-blotting检测表明,制备的多克隆抗体可以与融合蛋白swFcγRⅡB-His特异性结合。     

维氏气单胞菌脂蛋白的原核表达及其抗血清的抗菌作用研究

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的生物学功能,对脂蛋白基因进行原核表达,对表达产物进行鉴定并制备多克隆抗体研究其抗菌效应。通过PCR扩增脂蛋白基因,连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-Lpp。将重组质粒pET-32a(+)-Lpp转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达。利用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化,并采用SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白的表达产物。用纯化后的重组脂蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,多抗经皮下接种小鼠研究其抗菌效应。结果显示,经酶切鉴定和序列测定发现重组质粒pET-32a(+)-Lpp构建成功。通过SDS-PAGE检测发现,重组蛋白LPP在原核表达系统中以可溶性形式表达,分子质量约为69 ku。Western-blot结果显示,纯化后的重组蛋白LPP为单一条带。制备的多克隆抗体的效价为102 400,该多抗可提高荷菌小鼠的生存率,减少脾荷菌量。因此,本实验成功构建了重组质粒pET-32a(+)-Lpp,表达并纯化了重组蛋白LPP,制备的多抗具有抗菌作用,为该蛋白生物学功能的研究及疫苗的制备奠定了基础。     

尼帕病毒截短G蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

以截短的尼帕病毒（NiV）G基因原核表达产物为抗原建立检测尼帕病毒抗体的间接ELISA检测方法。对编码尼帕病毒G蛋白基因的部分序列进行扩增,将扩增获得的目的片段克隆至原核表达载体pET-30a（+）,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。菌落PCR鉴定后,在最佳诱导条件下表达目的蛋白。用Ni-NTA柱纯化截短的G蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。以纯化的蛋白为抗原建立尼帕病毒抗体间接ELISA检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性、稳定性进行验证。结果显示：成功构建重组质粒pET-30a(+)-NiV-G;表达的尼帕病毒截短G蛋白分子质量为50 ku,与预期值相符;截短的G蛋白能被His-tag抗体、抗尼帕病毒G蛋白粗提IgG识别。以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法检测已知阳性血清尼帕病毒抗体效价为1︰20 480,裂谷热病毒、西尼罗病毒及克里米亚-刚果出血热病毒阳性马血清的检测结果均为阴性,且该方法批内、批间试验变异系数均小于10%。结果表明,成功构建了重组质粒pET-30a(+)-NiV-G,并诱导表达尼帕病毒截短G蛋白。以该蛋白建立的尼帕病毒抗体...     

猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备猪巨细胞病毒(PCMV)gB优势抗原表位区重组蛋白的多克隆抗体,进一步分析PCMV gB蛋白的生物学特性,建立PCMV抗体血清学检测方法。对PCMV gB基因优势抗原表位区进行了PCR扩增,将回收的目的片段连接入pET32a(+)表达载体,转化入E.coli Rosetta(DE3),构建了重组表达菌E.coli Rosetta-pET32a(+)-gB,经IPTG诱导表达了gB优势抗原表位区重组蛋白。对重组蛋白进行纯化后,通过Western-blot试验验证了重组蛋白的反应原性,并免疫家兔制备了多克隆抗体。结果表明,该重组蛋白大量可溶性表达,且具有良好的反应原性。琼脂扩散试验及Western-blot检测表明,多克隆抗体效价达到1∶8,且能与gB优势抗原表位区重组蛋白特异性结合。证实,成功制备了PCMV gB优势抗原表位区重组蛋白多克隆抗体。     

伪狂犬病病毒UL36蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

伪狂犬病病毒UL36基因编码的皮层蛋白VP1/2在病毒粒子组装过程中发挥重要作用。本试验以UL36基因为研究对象,将截短的UL36基因克隆入载体pCold I,构建了重组原核表达质粒pCold I-UL36。经诱导表达,将包涵体形式表达的重组蛋白经过变性、亲和层析及复性后获得了纯度较高的蛋白。将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合和间接ELISA方法筛选出1株能稳定分泌针对UL36蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,被命名为UL36-6,抗体亚型鉴定结果为Ig G1和κ,制备的腹水抗体中和效价及纯度高,Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明单克隆抗体具有很好的特异性。综上所述,本研究成功制备出1株针对PRV UL36蛋白的单克隆抗体,为深入研究UL36蛋白的生物学功能奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株F基因的克隆与原核表达

提取小反刍兽疫病毒(PPRV)疫苗株Nigeria 75/1的总RNA,用RT-PCR方法扩增F基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒为模板克隆去掉N端信号肽和跨膜区的F基因(F-1)并亚克隆于原核表达载体pET-30a(+),得到重组质粒pET30-F-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫SPF家兔制备抗体,进行间接免疫荧光检测并用ELISA测定抗体效价.结果显示,目的基因正确插入了表达载体,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,用重组蛋白免疫3次后,兔血清抗体达到较高水平,Western-blot分析说明表达产物能够与兔血清抗体发生特异性反应,间接免疫荧光试验显示重组蛋白免疫兔阳性血清能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.表明,重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达,并且具有较好的反应原性.     

结核分枝杆菌rv1738基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌rv1738基因,并制备针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,以结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板,PCR扩增rv1738基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-rv1738。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍柱亲和纯化重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况,并用Western-bolt分析表达蛋白的反应原性。最后,以纯化的Rv1738蛋白免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a(+)-rv1738,经IPTG诱导在重组大肠杆菌中表达出分子质量为20ku的目的蛋白,并且以可溶的形式表达;对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白Rv1738能与家兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。纯化的Rv1738蛋白免疫小鼠后,能有效地刺激特异性抗体的产生,血清ELISA效价达到1∶8 800,且具有良好的特异性。以上结果表明,成功克隆表达了结核分枝杆菌rv1738基因,并制备了针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,这一结果为探索Rv1738蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制方面的潜能奠定了基础。