一株塞内卡病毒的分离与鉴定

2018年11月,河南南阳地区某养殖场发生了猪水疱病,经实验室检测确诊为塞内卡病毒(SVV)感染。选择SVV检测阳性的临床样品,处理后接种PK-15细胞,经多次传代培养,成功分离到1株塞内卡病毒,命名为HeNNY-1/2018株,并在PK-15细胞上对该毒株进行了空斑纯化和生长曲线的绘制。为进一步研究其遗传进化特点,采用RT-PCR技术扩增了其全基因组序列,并分别构建了基于VP1基因和全基因组的系统进化树。结果表明,分离株HeNNY-1/2018在感染后第24小时病毒效价最高为10~(7.6)TCID_(50)/m L。基因组核苷酸同源性分析显示,分离株HeNNY-1/2018与我国广西分离毒株GXHZH-1和美国毒株KS15-01呈现较高的核苷酸同源性,分别为98.0%和98.7%。进一步分子进化树分析显示,该毒株与2018年报道的广西地区的毒株处于较近的进化分支,而与我国早年间分离得到的其他毒株亲缘关系较远。本研究为河南地区塞内卡病毒流行状况提供了新的证据,也为下一步研究该病的诊断和防控提供了有力支撑。     

一株猪源脑心肌炎病毒的分离与鉴定

将江苏省某规模化猪场疑似脑心肌炎仔猪病料接种BHK-21细胞,并采用间接免疫荧光试验(IFA)、基因序列测定和动物人工感染试验进行鉴定,结果显示,BHK-21细胞接种病料样品后盲传3代出现细胞病变,病毒TCID50为10-9.2/mL;用脑心肌炎病毒(EMCV)单克隆抗体-IFA检测,在感染细胞的胞浆中可见特异性荧光;分离物的PCR扩增产物的基因序列与GenBank中的EMCV VP1基因的同源性为85.7%~99.8%;BALB/c小鼠人工感染该分离株后出现明显的临床症状和EMCV的典型病理变化,免疫组织化学试验证明,试验鼠脑组织中含有EMCV抗原,商品仔猪人工感染后未出现明显的临床症状及病理变化,证明该分离病毒为EMCV(NJ08株),且对BALB/c小鼠具有较强的致病作用。     

慢病毒载体介导稳定表达pAPN的Vero细胞系的构建及应用

将完整的pAPN序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry,并将该重组质粒pLVX-mCherry-pAPN与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染Vero细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达pAPN的细胞。通过RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)证明了所获细胞株能够稳定表达pAPN蛋白,命名为Vero-APN-B6。IFA试验和TCID50试验结果表明:与Vero细胞相比,Vero-APN-B6更能促进猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖。利用该细胞株成功地从猪小肠组织中分离到了PEDV SC-MS株;经过鉴定该毒株为变异毒株。     

牛病毒性腹泻病毒基因1型全基因组的测序分析

以我国新疆地区分离的1株牛源牛病毒性腹泻病毒基因1型毒株为研究对象,参照GenBank中的牛病毒性腹泻病毒1型基因组全序列,根据保守序列设计6对重叠引物,通过RT-PCR扩增出该毒株不同的cDNA片段,分别克隆到pMD19-T载体,转化受体菌JM109,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及测序分析,为了解该毒株的遗传变异及基因结构与生物功能的关系,为开发牛病毒性腹泻病毒新型疫苗奠定基础。测序结果表明,该病毒全基因序列核苷酸为12 302nt(GenBank登录号:JN704144),该病毒基因组具有一个11 694nt开放阅读框编码的多聚蛋白,5′-UTR长382nt,3′-UTR长224nt,BVDV1-3156的全基因组序列分析发现该毒株为BVDV1b亚型。Blast比对分析显示,该毒株与VEDEVAC株的相似性最高,为90.9%。该毒株与BVDV1型其他毒株的全基因组序列具有较大的差异。     

牛肠道病毒北京株的分离鉴定及全基因组分析

采用RT-PCR方法从北京某牛场有腹泻症状牛的粪便样品中检测到牛肠道病毒(bovine enterovirus,BEV),分离出1株病毒并将其命名为BJ101。然后,通过电镜观察、全基因组序列测定和同源性分析,对该毒株进行了验证。结果,BJ101分离株在MDBK细胞上的TCID50为1×10-6.42/0.1 m L,电镜观察到病毒颗粒直径为25~30 nm,无囊膜,呈典型的小RNA病毒粒子形态;BJ101株的基因组长度为7 409 bp,其中5′非编码区(UTR)长812 bp,3′UTR长72 bp,病毒基因组开放阅读框(ORF)全长6 525 bp。对全基因组序列进行比对分析显示,在5′UTR区、编码区和3′UTR区,BJ101分离株与BEV E2型毒株的核苷酸相似性最高。基于VP1基因的系统进化树表明,BJ101株是BEV E2型的成员。上述结果丰富了国内牛肠道病毒的基因库,为BEV的诊断及预防奠定了良好的基础。     

猪圆环病毒2型2d基因型毒株的全基因组序列分析

根据Gen Bank中猪圆环病毒2型(PCV 2)基因序列,设计特异性引物,用PCR方法从福州郊区某猪场疑似PMWS仔猪病料处理后接种育传三代的PK-15细胞中扩增1个分离毒株的全基因组,并将其克隆到p MD-18T载体上,对鉴定为阳性的重组质粒送检测序。对该分离株的基因全序列及其开放阅读框2(ORF2)进行同源性分析及遗传进化关系分析。PCR鉴定结果显示,本试验中分离到的病毒属于PCV2,命名为PCV2-FZ株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组大小为1 767 bp,含有11个开放性阅读框,其中ORF2大小为705 bp,共编码234个氨基酸。PCV2-FZ株与参考毒株基因全序列的核苷酸同源性为94.3%~99.4%,与SD毒株同源性最高,为99.4%;与DK1980PMWSfree和DK1990PMWSfree毒株同源性最低,为94.3%。分离株与参考毒株ORF2核苷酸同源性为89.2%~99.4%,其中与SD毒株同源性最高,为99.4%,与DK1980PMWSfree毒株和DK1987PMWSfree毒株同源性最低,均为89.2%。全基因组与ORF2序列遗传进化树分析均表明,PCV2-FZ株属于PCV2d基因型。本研究从福建省首次分离并鉴定了1株PCV2d型毒株,这对PCV2流行病学研究和遗传变异分析具有重要意义。     

一株洞庭湖候鸟新城疫病毒的分离鉴定及基因组特征分析

为监测湖南省洞庭湖候鸟携带新城疫病毒的现状,本研究于2014年春季在湖南洞庭湖畔采集了150份候鸟粪便样品。经SPF鸡胚分离纯化和RT-PCR鉴定,获得1株新城疫病毒,命名为Swan/Hunan/123/2014(HuN,GenBank登录号:KT894018)。利用RT-PCR方法扩增了HuN株全基因组,并进行基因组序列测定。序列分析表明,HuN株基因组长度为15 186bp,编码的F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112 GK-Q-G-R-L117,符合新城疫经典弱毒株的分子特征。F基因相似性分析显示,其核苷酸序列与Queensland V4疫苗株、La Sota疫苗株和ZJ1毒株的同源率分别为99.8%、90.4%、81.3%。对HuN株的F基因、HN基因和全基因组遗传进化分析结果均显示,此毒株与Queensland V4株聚为一类,属于副黏病毒血清1型中的ClassⅡ类基因Ⅰ型新城疫病毒。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株(QY株)的F基因和HN基因。然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸。经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%。     

猪生殖与呼吸综合征病毒NM1株的分离鉴定及其Nsp2基因的序列分析

从内蒙古某猪场患高热症病猪病料中分离到1株病毒,该病毒能在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变.经RT-PCR法鉴定证明,该病毒为美洲型PRRSV,将其命名为NM1.应用设计的特异性引物扩增NM1株的Nsp2基因,并与国内外PRRSV分离株的Nsp2基因序列进行了比较.结果表明,NM1株Nsp2基因推导的氨基酸序列出现30个不连续的缺失,与PRRSV高致病性毒株HUN4、HuB2、JXA1的核苷酸序列同源性分别为99.1%、99.0%和98.9%.动物回归试验结果显示,人工感染的5头仔猪全部发病,其中3头死亡,说明NM1株为发生变异的PRRSV,其致病力有所增强.     

基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆的构建与生物学特性

参考甲型塞内卡病毒（SVA）CH/HuB/2017株全基因组序列,构建SVA通用型载体,合成SVA FragⅠ和FragⅡ基因片段,并通过无缝克隆技术依次将病毒基因片段插入通用型载体,获得包含病毒全基因组的真核转录质粒pcDNA-SVA;经双酶切和测序验证后,在IBRS-2细胞上进行转染和传代,以获得拯救毒株rSVA-CH/HuB/2017;经遗传稳定性评价后,利用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光和半数组织培养感染量等试验,鉴定和分析拯救毒株在猪肾细胞系IBRS-2和PK-15中的生物学特性。结果显示,重组质粒pcDNASVA直接转染普通敏感细胞系IBRS-2,即可快速拯救出含有沉默突变NheⅠ分子标记的毒株,且具有良好的遗传稳定性;拯救毒株和野生亲本毒株在IBRS-2和PK-15细胞中的复制和增殖特性相似。结果表明,通过建立一种基于T7启动子、RNA聚合酶Ⅱ启动子、终止子、核酶HamRz和HDVRz等元件的SVA单质粒高效拯救系统,可以在质粒水平快速编辑病毒基因组,为定向改造和拯救病毒提供了基础性技术平台。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及其基因组变异特征的研究

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在河南省新乡地区猪体内的进化情况,笔者对河南省新乡地区某猪场送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料进行了病毒的分离鉴定,并采用PCR扩增得到了该病毒的全基因组序列,同时对分离病毒株的GP5和NSP2序列进行了比对分析。结果显示:成功分离并鉴定出1株美洲型PRRSV(XX2015),与中国代表毒株CH-1a中的核苷酸同源性是92.8%,与高致病性(HP)-PRRS病毒代表株Hu N4、Hu B1、He Nan-1、He NAN-A14株的核苷酸同源性则分别为97.2%、97.0%、97.2%、94.4%。对基因组的进一步分析表明,该毒株GP5蛋白非中和性表位处存在氨基酸变异,NSP2蛋白在第481位、第485~488位、第533~561位共缺失34个氨基酸。XX2015分离株是HP-PRRSV的一个代表株,该病毒株在NSP2蛋白中存在跳跃性突变,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子进化提供了分子证据。     

猪伪狂犬病病毒HLJ8株的分离与鉴定

2013年黑龙江省某猪场发生仔猪死亡并且伴有神经症状,采集死亡猪脑组织,经PCR检测、病毒电镜观察,确诊为伪狂犬病病毒(PRV)感染,遂将该毒株命名为HLJ8。进一步对病毒gE基因的序列分析表明,该毒株与2012年的中国分离株在同一个相对独立的分支中,氨基酸序列的同源性在94%~100%之间;与2011年之前分离的毒株的亲缘关系较远。小鼠毒力试验结果表明,高剂量(1×103 PFU/mL)的HLJ8株可以引起小鼠死亡以及皮肤瘙痒等典型的PRV感染症状,但其毒力略低于经典强毒株PRV SC株。     

中华按蚊源日本脑炎病毒的分离鉴定及其分子特征的分析

为了解上海市蚊源日本脑炎病毒(JEV)的分子特征,2014年从上海市嘉定区猪场采集蚊媒样品1万余份,采用BHK21和C6/36细胞培养法进行病毒分离,通过RT-PCR和IFA技术对分离株进行鉴定。结果表明,分离到1株JEV,命名为JD-15,源自中华按蚊。用JD-15株分别感染BHK21和C6/36细胞,72 h后所有细胞均发生明显病变(CPE),其细胞半数感染量(TCID50)为1.96×106PFU。用分离株JD-15脑内接种3周龄乳鼠,结果测得半数致死量(LD50)为4.2×101PFU,表明该毒株具有较强的神经毒力。对JD-15株的E基因进行克隆测序及进化分析,结果显示,该株JEV属于基因Ⅲ型,与减毒活疫苗株SA-14-14-2的E基因核苷酸序列的同源性为98.1%,氨基酸序列的同源性为97.5%。本研究为乙型脑炎的流行病学调查提供了科学依据,对上海市蚊虫及蚊媒病的防治具有重要意义。     

貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。     

猪流行性腹泻病毒YZ2016全基因组测序与稳定性分析

2016年我国江苏扬州某规模化养猪场暴发严重腹泻,本实验室通过RT-PCR确定其病原为猪流行性腹泻病毒(PEDV)。将阳性样品接种Vero细胞,盲传5代后出现典型病变,并通过RT-PCR及间接免疫荧光试验确定成功分离到PEDV毒株,命名为PEDVYZ2016。采用分段重叠法对分离株基因组扩增测序,获得其全长序列。遗传进化分析显示PEDV YZ2016与近年流行毒株亲缘关系较近,与经典毒株亲缘关系较远。PEDV YZ2016与BJ-2011-1、LZW全基因组核苷酸序列一致性可达99. 2%,与BJ-2011-1、OKN-1/JPN/2013 S基因推导氨基酸序列一致性可达98.5%。此外,分离株S基因发生多处点突变,导致其抗原表位及糖基化位点均发生部分改变。同时,序列比对分析显示不同代次的S、ORF3、N基因核苷酸突变率均极低。结果表明,本研究分离的PEDV YZ2016株属流行变异毒株,且在传代过程中遗传稳定性良好。     

猫细小病毒广西分离株FPV-GX01全基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西地区猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的生物学特性,阐明其基因组与遗传进化等特征。笔者采集经胶体金检测FPV阳性的粪便样品接种FK81细胞,进行病毒分离及理化特性鉴定,同时利用PCR分段扩增病毒基因组DNA,并与国内外分离株进行同源性及遗传进化比较分析。结果显示,分离株在FK81细胞上盲传3代后出现CPE,猪红细胞血凝价达1∶1 024,第5代病毒TCID50测定为10-5.2/0.1 m L,该毒株对热、酸、氯仿及乙醚有较强的抵抗力,将分离株命名为FPV-GX01。全基因测序结果表明,分离株基因组为4 901 bp,与2007年我国猫源细小病毒株FPV-XJ1同源性高达99.0%,属同一分支。氨基酸位点分析显示,FPV-GX01株VP2蛋白功能较少发生突变,与犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)氨基酸位点存在宿主差异;FPV-GX01 NS1蛋白序列上没有VP2蛋白稳定,第619位异亮氨酸突变成苯丙氨酸。广西地区分离的猫细小病毒也在不断发生遗传变异进化,本研究对该地区猫细小病毒的进化特征提供了一定的参考。     

中国蓝舌病病毒血清5型毒株的分离与鉴定

为掌握我国云南省蓝舌病病毒(BTV)的流行情况,笔者在云南省师宗县设定哨兵动物,定期从哨兵动物上采集血液进行BTV分离。2012年笔者通过"鸡胚-C6/36细胞-BHK细胞"接种的方式从哨兵牛上分离出1株BTV(毒株号:V084/YN/2012),电镜观察显示,病毒粒子无囊膜,直径约80 nm,表面分布有纤突。血清中和试验表明,分离的病毒为蓝舌病病毒血清5型(BTV-5),使用抗BTV-5型的多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光染色,进一步证实分离毒株为BTV-5型。设计特异性引物对V084/YN/2012毒株的Segment 2 (Seg-2)与Segment 3 (Seg-3)的ORF区进行RT-PCR扩增与克隆测序,序列分析结果显示,V084/YN/2012与BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)的Seg-2核酸序列相似度为95.4%,在系统发育树上聚为一簇,属Seg-2基因E型;Seg-3在系统发生树上属Eastern topotype型,与中国BTV-4型YTS4毒株聚为一簇,核酸序列相似度高达97.5%。病毒蚀斑与增殖曲线测定试验表明,V084/YN/2012与实验室保存的BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)在BHK21细胞上可形成形态大小相近的病毒蚀斑,二者在BHK21细胞上的增殖特性也基本一致。本研究确认了BTV-5型V084/YN/2012毒株在我国的分离,掌握了病毒Seg-2与Seg-3基因的遗传特征以及病毒在BHK21细胞上的增殖特性。研究结果为进一步开展中国BTV-5型的基因组测序、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒四川株的分离鉴定及其S基因的克隆和序列分析

通过核酸类型试验、脂溶性敏感试验,鉴定了1株分离自四川某猪场腹泻病猪粪便的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。经电子显微镜观察,可以看到大小约90 nm的病毒粒子;通过中和试验,将病毒细胞液与TGEV超免疫血清进行中和反应,显示较高的中和抗体效价。根据GenBank中的TGEV序列,设计了1对包含TGEV S基因1 760 bp部分片段的引物,经RT-PCR扩增获得了1条约1.8 kb的条带,通过低熔点琼脂糖凝胶纯化回收该片段后,将其连接在pMD 18-T载体上,转化DH5α大肠埃希氏菌,用双酶切和PCR对重组质粒进行鉴定并测序,经用DNAStar软件进行同源性分析和多重序列比较,TGEV四川株(SC-A)与国外报道的部分TGEV分离株具有高达98.8%的同源性。     

2007-2011年广东省猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析

为了解广东省2007-2011年猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株的遗传变异情况,采用PCR方法对本实验室分离到的49株PCV2分离株进行全基因组克隆和序列分析。所分离的毒株全长分别为2株1 766bp、45株1 767bp、2株1 768bp。通过序列比对进行遗传变异分析,无论是这49株病毒间还是与GenBank中的8株PCV2基因组间的核苷酸同源性均为93.2%～99.9%;在遗传演化关系上,49株分离株分布于2个大群,分别为PCV2b和PCV2d分支。提示目前疫苗毒株不处于广东地区PCV2流行毒株分支中,应该引起高度的重视。