禽多瘤病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)的快速诊断方法,根据APV VP4基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,验证了其特异性、敏感性和重复性,并利用建立的方法对采集的临床样本组织进行检测。结果显示,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1.0×10⁹～1.0×10²copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.021,检测下限为1.0×10¹copies/μL,与其他禽源病毒未发生交叉反应,重复性试验的变异系数均小于2%,重复性好,并且该方法在实际临床检测中可行。上述结果表明,建立的方法可用于禽多瘤病的早期诊断和APV快速检测。     

禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立禽呼肠孤病毒(ARV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切,得到线性化转录模板DNA,将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板,用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物,以体外转录的RNA作为标准品,应用SYBR GreenⅠ染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,比常规的RT-PCR敏感1×103倍,可检测到5.2×102个拷贝的标准品RNA,与NDVI、BDV、MG均不反应;从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒,病毒含量为1×105~1×107个拷贝/μL。表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于ARV的检测。     

羊痘病毒实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

参照羊痘病毒(CaPV)P32的基因序列,设计合成了2套引物和1条探针,建立了实时荧光定量PCR技术,对细胞培养物、皮肤丘疹、痂皮等组织病料中的GPV进行了特异性检测和敏感性试验。结果显示,用300 nmol／L引物浓度和200 nmol／L探针浓度,获得的Cr值较小,而△Rn最大;可检测到相当于0．1 TCID50的病毒DNA;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0．999 5以上;组内和组间试验重复性的变异系数分别为2．3％和3．4％;与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,可同时检测大量样品等优点。表明。荧光TaqMan PCR是一种检测CaPV的良好方法,可对组织病料中低含量的CaPV或持续带毒宿主进行准确检测。     

基于TaqMan探针的猪圆环病毒1型实时荧光定量 PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因,构建了重组质粒pMD-ORF2并将其作为标准阳性模板.通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测PCV1的荧光定量PCR方法.结果显示,该方法的检测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL;对起始浓度为1.0×107、1.0×106、1.0×105拷贝/μL标准品的最终实际测得值分别为1.001×107、0.869×106和0.988×105拷贝/μL,变异系数分别为4.758%、1.865%和3.836%.表明,此方法具有良好的准确性和重现性.     

H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV.使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-N2NA标准品绘制标准曲线,其相关系数分别为0.990 15(H3HA)和0.999 47(N2NA).检测结果显示,该方法的敏感性可达100 copies/μL,除H3N2亚型SIV外,对H1亚型、H9亚型SIV以及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒和猪2型圆环病毒的检测均为阴性,应用该方法对实验室感染样品进行检测,其结果与病毒分离结果的符合率为95.83%.表明,该方法特异性强、重复性好,有望成为H3N2亚型SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法.     

鸡传染性喉气管炎TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的快速诊断方法,基于ILTV g B基因设计特异性探针和引物,建立一种基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。结果显示,ILTV qPCR方法的标准曲线为y=-3.892 9x+44.607,线性相关值(R²)为0.998 8。该方法的最低检测限为1.0×10 copies/μL,批内与批间重复性检测的变异系数均小于5.64%,且与其他鸡源病原体无交叉反应。临床样本检测结果显示,该qPCR方法的检测阳性率为98.7%,而普通PCR的检测阳性率为92.61%。以上结果表明,该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于ILTV的疫病监测和流行病学调查,为ILTV感染的预防和诊断提供了有力工具。     

猫细小病毒和猫疱疹病毒1型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时检测猫细小病毒（FPV）和猫疱疹病毒1型（FHV-1）的双重荧光定量PCR方法,针对FPV的VP2基因、FHV-1的UL21基因设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了双重荧光定量PCR方法,并绘制了标准曲线,其相关系数（R2）均为0.999,具有良好的线性关系。结果显示,FPV、FHV-1最低检测限分别为4.87和2.21 copies/μL;对猫的常见病毒及细菌均无非特异反应;批内、批间试验的变异系数均小于2%。证明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好。用建立的方法对178份样本进行检测,结果,FPV和FHV-1的阳性检出率分别为73.65%和16.85%,二者混感阳性率为15.73%,与临床确诊结果一致。上述结果表明,本研究建立的方法可用于FPV、FHV-1感染的早期诊断、定量检测和流行病学调查等。     

猪附红细胞体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能定性与定量检测猪附红细胞体的方法,根据GenBank中猪附红细胞体的16SrRNA基因高度保守区设计了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了一种快速检测猪附红细胞体核酸载量的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法在107～101 copies/μL具有良好的线性关系(RSq=0.999)。能检测到模板的下限为30copies,灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。该检测方法与其他猪常见病病原体无交叉反应,具有良好的重复性。对临诊疑似猪附红细胞体感染猪血液进行了检测,其检出率比常规PCR方法高10%。表明该方法可用于临床上猪附红细胞体的检测及定量分析。     

内蒙古绵羊梅迪-维斯纳病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种检测内蒙古地区绵羊梅迪-维斯纳病毒(MW)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据高度保守的gag基因序列设计特异性引物和探针,通过对反应条件和反应体系的优化,建立了快速检测MW的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果显示,扩增相关系数为0.999,对重组标准质粒的最低检测量为1.0×100 copies/μ...     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏检测鸡毒支原体(MG)的方法,本研究根据GenBank中登录的MK984197.1,针对PAPV基因的保守序列设计了1对特异性引物探针,将PCR扩增后的PAPV基因克隆至pMD19-T载体,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒标准品,建立鸡毒支原体TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性等进行优化与验证。结果显示,C_t值与标准模板在0.53×10⁸～0.53×10³copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R²)为0.998,线性方程的斜率为-3.219,最低检测限度为0.53×10²copies/μL;经组内和组间重复试验,两者变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性;与鸡滑液囊支原体(MS)、火鸡支原体(MM)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用所建立的MG-TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对部分地区抽检的60份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。上述结果表...     

犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。     

二重微滴式数字PCR定量检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体方法的建立

为绝对定量检测禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）和鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）,本研究建立了二重微滴式数字PCR(ddPCR)。根据已发表的ARV S1基因和MS的VlhA基因序列保守序列,分别设计了针对S1和VlhA基因的特异引物和探针,通过优化引物和探针的浓度及反应条件后,建立了二重ddPCR定量检测ARV和MS方法,并对建立方法的特异性、敏感性和重复性进行测试。结果显示,优化后最佳的引物和探针浓度分别为1.2和0.35μmol/L,最佳退火温度为55℃。特异性检测结果只检出ARV和MS,没有检出其他对照的禽病病原。敏感性检测结果显示,该方法检测ARV及MS重组质粒DNA的检出限分别为微滴数6.3和5.4 copies/μL,检测方法的检出限与单重ddPCR最低检出限相同,敏感性比荧光定量PCR方法高10倍。对3个连续稀释的ARV和MS重组质粒DNA检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对92份病鸡关节囊、喉拭子及肺样品进行检测,二重ddPCR方法检出12份样品呈ARV阳性,9份样品呈MS阳性,其中2份样品呈ARV和MS阳性,A...     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针,建立了快速检测沙门茵的实时荧光定量方法,并对反应条件进行了优化,组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测,该试剂盒的检测灵敏度达4．5 CFU(25μL反应体系),比常规PCR高100倍,而且稳定性良好,至少可以冷冻保存9个月。结果表明,所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点,适于大量样品的检测。     

猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。同时用建立的检测方法对组织病料进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达5.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对东莞、增城、湛江等地的猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法与常规RT-PCR检测方法的阳性符合率为100%。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前PRRS的诊断需要。     

番鸭呼肠孤病毒乳胶凝集试验检测方法的建立

建立了用纯化的抗番鸭呼肠孤病毒(DRV)抗体致敏乳胶检测DRV抗原的方法。通过试验,确定抗体致敏乳胶的最佳浓度为1∶10(IgG蛋白浓度为0.424 2 mg/mL),最佳致敏温度为37℃,最佳致敏时间为120 min。用所建立的方法对人工感染的1 日龄雏番鸭30 只进行粪便检测,结果表明,感染后第3 d粪便中即可检测到病毒,直至人工感染鸭全部死亡都可从粪便中检出病毒抗原;对同样人工感染的30只1日龄雏番鸭的心、肝、脾病料用所建立的方法检测,结果表明,感染后第4 d,2/3番鸭脾病料检出阳性;感染后第5 d,2 只死亡鸭中有1 只肝病料检出阳性,脾病料2只都呈阳性;此后的病死鸭脾和肝病料均为阳性,而心则未检出阳性。     

驼源性核酸多重快速荧光定量PCR检测方法的建立及检测试剂盒的研制

为准确鉴定骆驼肉乳制品,减少市场中用低价肉乳制品冒充高价肉乳制品的欺诈违法行为,保障食品安全,维护公平合法贸易,建立多重实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）快速高通量检测骆驼核酸的方法。利用多重实时荧光定量PCR法构建肉乳制品中骆驼成分检测方法,设计了哺乳动物18S rRNA基因与骆驼cytB基因的引物探针,对市面上常见肉乳制品进行检测。结果显示,本研究中针对肉乳制品的核酸提取方法不受食品添加剂影响,提取过程简便快捷高效,可于20 min之内完成提取;建立的多重实时荧光定量PCR法具有良好的特异性和灵敏度,在牛奶粉、羊奶粉、驼奶粉、骆驼肉制品、鲜猪肉和鲜骆驼肉6种样本中,成功特异地检测出骆驼成分,且在驼奶粉质量分数为30%、20%、10%、8%、5%、3%、1%和0.5%的条件下进行检测,全部成功检测出,准确度达100%。结果表明,建立的骆驼源性成分多重快速实时荧光定量PCR法可有效鉴别肉乳制品中的骆驼源性基因。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

牛副流感病毒3型TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群临床样本进行了检测。结果显示,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR的最低检测限为17.6copies/μL,同时进行批内、批间5次重复性试验,变异系数均小于2.5%。应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒1型,结果均为阴性,说明建立的方法特异性较强。用建立的方法检测人工感染BPIV3的犊牛鼻拭子样本,检测结果与样本TCID50的测定结果相符合,但比其更敏感。结果表明,本试验中建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR可以作为BPIV3早期诊断及定量分析的有效技术手段。     

猪乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×10¹～7.2×10⁸ copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×10⁰copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。