猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因的克隆与表达

根据GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TS株全基因的核苷酸序列,设计1对引物,采用RT-PCR技术扩增出一条含S蛋白A、D位点的S基因,大小约980bp。将其插入Simple-T克隆载体中,进行PCR、酶切鉴定及序列测定。将阳性基因插入表达载体pET-28a(+)中,转入Rossetta(DE3)感受态细胞,经诱导表达后,表达产物用SDS-PAGE和Western-blot进行分析。结果显示,表达产物的分子质量约为33.7ku,主要以包涵体的形式存在。Western-blot分析表明,表达的S蛋白能被兔源抗TGEV阳性血清所识别,说明表达产物具有反应原性。     

猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种高效准确检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的实时荧光定量PCR方法,以FIPV N基因为靶基因设计特异性探针和引物,构建质粒标准品。通过优化反应条件,建立real-time PCR方法,并进行临床检测。经方法优化,所建立方法的标准曲线为y=-3.137x+42.243,R²值为0.999,扩增效率E为108.0%。该方法与猫瘟病毒(FPV)、猫疱疹病毒(FHV)和猫杯状病毒(FCV)无交叉反应,特异性良好;检测最低拷贝数为9.250 copies/μL,比常规PCR方法高出100倍;组内、组间变异系数均小于5.0%,重复性好。采用建立的方法和EvaGreen real-time PCR方法对39份临床样品进行检测,结果,检出阳性样品数分别为24和22,经Kappa检验,两者高度一致。上述结果表明,本研究成功建立了高效、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,可用于FIPV的临床病例检测。     

猪圆环病毒4型Cap蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

为了研究猪圆环病毒4型(porcine circovirus type 4,PC V4)Cap蛋白功能,本研究构建了其原核表达质粒pCzn1-Cap,并对其进行了诱导表达和蛋白纯化.以纯化的重组蛋白His-Cap作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫后的小鼠脾细胞融合,通过ELISA筛选得到了 ...     

伪狂犬病病毒gE基因的表达及gE蛋白单克隆抗体的制备

以猪伪狂犬病病毒(PRV)Min-A株pMD-gE质粒为模板,利用所合成的特异性引物进行PCR扩增,获得了1 000 bp的DNA片段,并将其克隆至表达载体pET-30a中,转化到大肠杆菌中进行了原核表达,对表达产物进行了抗原性分析;在此基础上,用纯化的gE蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选和鉴定了分泌抗gE蛋白单抗的杂交瘤细胞株。结果显示,原核表达的gE蛋白具有良好的抗原性,其分子质量为46 ku。筛选获得3株分泌抗gE蛋白单抗的杂交瘤细胞株,Western-blot和间接免疫荧光试验证实,所获得的3株单抗具有良好的特异免疫反应原性。3株单抗均为IgG1亚类,且轻链均为κ链。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白D位点单克隆抗体的制备和鉴定

通过大肠杆菌表达了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的D位点,并以D位点的六聚体作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法进行克隆。结果显示,得到3株能稳定分泌抗TGEV S蛋白D位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2C104、5E1012和4B101,其中2C104和5E1012分泌抗体类型是IgM亚类,4B101为IgG1亚类。2C104、5E1012、4B101三株杂交瘤细胞培养上清液的间接ELISA抗体效价分别为1∶128、1∶128、1∶64,腹水效价分别为1∶103、1∶104、1∶4×103。间接免疫荧光鉴定结果表明,3株细胞均能和TGEV发生特异性反应,且在连续传代和冻存后仍能稳定分泌抗体。本研究针对S蛋白D位点制备了单克隆抗体,为传染性胃肠炎的诊断和TGEV与宿主互作机制的研究奠定了基础。     

盖塔病毒6K蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为用于猪群中盖塔病毒(Getah virus,GETV)的流行病学调查,并研究其6K蛋白功能,制备了该蛋白的单克隆抗体.将6K基因克隆至原核表达载体pCold-TF,并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG低温诱导表达.将诱导的重组菌超声裂解,离心后收集上清,经过镍柱亲和和切胶纯化后,免疫BALB/c小鼠,取免疫...     

Ⅰ型猫疱疹病毒gB蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备

为获得免疫原性好的Ⅰ型猫疱疹病毒（FHV-1）gB截短蛋白和制备特异性的多克隆抗体,以用于检测gB蛋白的表达水平变化及FHV-1的血清学诊断技术研究,本试验截取gB蛋白的优势抗原区并插入pET-30a载体,构建原核表达质粒pET-30a-gB,测序正确后转入BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。通过亲和层析纯化蛋白,将获得的重组蛋白免疫6周龄雌性新西兰大白兔制备多克隆抗体。采用固定病毒-稀释血清法测定多抗中和效价,使用FHV-1感染后的细胞样本进行间接免疫荧光和West-blotting检测其反应性和特异性。结果显示,成功构建了表达FHV-1截短gB蛋白的重组质粒pET-30a-gB,在37℃诱导8 h后主要以包涵体形式表达。中和试验结果显示,制备FHV-1 gB截短蛋白多克隆抗体中和效价为1∶48。间接免疫荧光和West-blotting试验结果表明,所制备多克隆抗体具有良好的反应性和特异性,可特异性检测出FHV-1感染细胞中的gB蛋白。结果表明,原核表达的gB截短重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体具有较高的中和效价以及较好的反应性和特异性,为进一步解析gB蛋白的生物学...     

传染性支气管炎病毒TY1株结构蛋白基因部分片段的表达

根据已报道的传染性支气管炎病毒S基因序列设计了1对引物,利用从传染性支气管炎病毒TY1株中提取的RNA,经PCR扩增获得了300 bp的产物;序列测定与分析表明,所扩增产物是传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的部分片段。将扩增片段插入pET32a构建表达载体,并于大肠埃希氏菌BL21中进行表达;结果表明,该片段在大肠埃希氏菌中成功表达,产物为30 ku、以可溶性形式存在的蛋白。Western-blotting分析表明,该蛋白可与传染性支气管炎病毒TY1株阳性血清发生反应。     

施马伦贝格病毒N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

为了制备针对施马伦贝格病毒(SBV)N蛋白的单克隆抗体,将SBV N基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET28a-SBV-N,转化至BL21(DE3)后进行原核表达并纯化.以纯化的重组SBV-N蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体(McAbs),最终获得了3株McAbs,依次命名为2D6、4F10和...     

猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA法对融合细胞进行筛选,采用有限稀释法对阳性细胞进行4次亚克隆,获得了3株能稳定分泌N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3.分别采用体外培养法、诱导腹水法和实体瘤法制备单克隆抗体,并用间接ELISA法检测其效价,结果显示,这3株杂交瘤细胞的细胞培养上清、小鼠腹水和血清的单抗效价均分别为1:512、1:10~5、1:10~5,其中以诱导腹水法制备的单抗产量和效价最佳.间接免疫荧光试验结果显示,这3株单抗均能与TGEV感染的ST细胞产生特异性免疫荧光,而不与猪细小病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒等发生交叉反应;经鉴定,3株单抗的亚类均为IgG2a,这3株杂交瘤细胞具有良好的遗传稳定性.     

传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp10单克隆抗体的制备

为了体外获得大量表达的传染性支气管炎病毒(IBV)的非结构蛋白10(nsp10)并制备其单克隆抗体,通过RT-PCR扩增获得了IBV nsp10基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中。重组载体pET-28a(+)-nsp10转化的表达宿主菌在1mmol/L IPTG诱导5h获得高效表达。用纯化的重组蛋白Hisnsp10免疫小鼠制备单克隆抗体,采用有限稀释法经过3轮筛选和鉴定最终获得了2株分泌抗nsp10单克隆抗体的细胞株1G2和3G7。2株单克隆抗体在Western-blot分析中均与重组His-nsp10蛋白反应,并通过间接免疫荧光试验识别了4种不同毒株感染的DF-1细胞。IBV nsp10单克隆抗体的成功制备为IBV的检测和nsp10蛋白功能的研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。     

水牛匈爱病毒结构蛋白VP1的截短表达及多克隆抗体的制备

为了制备水牛匈爱病毒（BufHuV）结构蛋白VP1截短基因的多克隆抗体,将病毒的VP1截短基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）获得重组质粒pET-32a-BufHuV-VP1,重组质粒转化至BL21感受态细胞（DE3）后诱导表达,VP1截短蛋白的分子质量约为31.5 ku,主要以包涵体的形式表达。以纯化好的重组蛋白免疫昆明小鼠以制备多克隆抗体,通过Western-blot与IFA鉴定其特异性。结果显示,制备的小鼠多克隆抗体能与纯化的VP1重组截短蛋白和感染BufHuV的细胞表达的VP1特异性结合,表明多克隆抗体具有良好的反应原性和特异性。水牛匈爱病毒VP1截短重组蛋白及其多克隆抗体的成功制备为研究BufHuV致病机制、VP1蛋白功能以及血清学检测方法的建立提供了材料基础。     

马立克氏病病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得分泌抗鸡马立克氏病病毒(MDV)gE囊膜糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将pGEX-6P-1表达的重组蛋白gE作为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,共筛选获得4株能够稳定分泌抗MDV gE蛋白抗体的杂交瘤细胞株。抗体亚型鉴定结果表明,4株均为IgG1型,轻链为κ链。间接免疫荧光结果显示,4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能特异性识别MDV,并具有一定的中和活性。本研究对MDV诊断、抗原表位分析及鉴定等具有重要的应用价值。     

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用纯化的猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗EMCV VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10B和11D。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1 600和1∶800,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗的亚类均为IgG2a,均能特异性识别重组VP1蛋白,但它们识别VP1蛋白的不同表位。间接免疫荧光和免疫组织化学试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别EMCV。     

山羊痘病毒L1蛋白的原核表达及其功能分析

为了探究山羊痘病毒L1蛋白在病毒感染Vero细胞过程中的作用,将山羊痘病毒L1蛋白基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物。表达的目的蛋白经镍亲和柱纯化后免疫家兔制备了抗血清,通过蛋白封闭试验和血清抑制试验研究了纯化蛋白及其抗血清对山羊痘病毒感染的抑制作用。结果显示,成功表达了山羊痘病毒的L1蛋白,表达产物为48ku左右的重组蛋白,它能被山羊抗山羊痘病毒阳性血清识别。加入L1蛋白封闭,可使山羊痘病毒感染细胞的病变时间推迟12h,病毒与L1蛋白抗血清作用后效价下降了87.8%。结果表明,L1蛋白可能是山羊痘病毒的受体结合蛋白,并能在病毒侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。     

蓝舌病病毒NS2蛋白单克隆抗体的制备及其应用

本研究旨在制备针对蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)非结构蛋白NS2的单克隆抗体,进而用于C-ELISA鉴别BTV自然感染动物与BTV灭活疫苗免疫动物。通过原核表达BTV NS2蛋白的高保守多肽(1~228 aa)来制备抗原,并通过免疫BALB/c小鼠制备抗BTV NS2蛋白的单克隆抗体,结果,获得1株分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞,命名为BTV-2A4。鉴定结果显示,该单克隆抗体的亚类/亚型为IgG1/κ;其抗原表位在NS2蛋白的91~138 aa区间;能特异性地与1~24型BTV的NS2蛋白反应;可应用于Western-blot、间接免疫荧光、间接ELISA及C-ELISA技术。C-ELISA应用的试验数据表明,BTV疫苗免疫动物及未被BTV感染动物的血清中检测不到NS2抗体,而BTV感染动物的血清中大多可被检出NS2抗体。     

尼帕病毒截短G蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

以截短的尼帕病毒（NiV）G基因原核表达产物为抗原建立检测尼帕病毒抗体的间接ELISA检测方法。对编码尼帕病毒G蛋白基因的部分序列进行扩增,将扩增获得的目的片段克隆至原核表达载体pET-30a（+）,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。菌落PCR鉴定后,在最佳诱导条件下表达目的蛋白。用Ni-NTA柱纯化截短的G蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。以纯化的蛋白为抗原建立尼帕病毒抗体间接ELISA检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性、稳定性进行验证。结果显示：成功构建重组质粒pET-30a(+)-NiV-G;表达的尼帕病毒截短G蛋白分子质量为50 ku,与预期值相符;截短的G蛋白能被His-tag抗体、抗尼帕病毒G蛋白粗提IgG识别。以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法检测已知阳性血清尼帕病毒抗体效价为1︰20 480,裂谷热病毒、西尼罗病毒及克里米亚-刚果出血热病毒阳性马血清的检测结果均为阴性,且该方法批内、批间试验变异系数均小于10%。结果表明,成功构建了重组质粒pET-30a(+)-NiV-G,并诱导表达尼帕病毒截短G蛋白。以该蛋白建立的尼帕病毒抗体...     

赤羽病病毒核衣壳蛋白原核表达及单克隆抗体制备

为制备赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳(N)蛋白单克隆抗体,本研究构建了pET-28a-AKAV-N重组质粒,并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和镍柱纯化获得重组N蛋白.用重组N蛋白4次免疫小鼠后,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,利用亚克隆技术和ELI...     

新城疫病毒ClassⅠ强毒株L基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法从新城疫病毒(NDV)ClassⅠ强毒株9a5b中扩增出了L基因C末端的基因片段,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,测序验证后转化入表达宿主菌BL21进行IPTG诱导表达,表达的蛋白接种8周龄BALB/c小鼠,制备L蛋白的单克隆抗体,用间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western-bolt方法共同检测所获得的抗体。结果显示,重组菌可表达出分子质量约为39ku的重组融合蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。多种方法筛选显示成功制备了4株单克隆抗体。免疫特异性鉴定结果表明,在所获得的单抗中,4株单抗均具有ELISA和IFA效价,且4株单抗与ClassⅠ毒株的反应均强于与ClassⅡ毒株的反应。