鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析

采用抑制性消减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析。结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段。经同源分析,这些序列可分为3类:噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列。这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素I、paJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因。结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株基因组间存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础。     

猪沙门菌分离株的毒力及耐药特征

为了检测哈尔滨市猪沙门菌分离株的毒力及耐药情况,对采自健康猪群的非重复35株沙门菌进行了血清型鉴定、人工感染及毒力试验、药敏试验、耐药基因的检测与转移试验。结果显示,检出的最主要血清型为猪霍乱沙门菌,共25株,占71.4%(25/35),其次为猪伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌。被攻毒小鼠全部死亡,肝、脾、胃出现不同程度的出血性病变。大部分沙门菌株对临床常用的抗菌药物已产生多重耐药,其中对氨苄青霉素、氟喹诺酮类、四环素和氨基糖苷类抗生素的耐药性较高,而碳青霉烯类抗生素的体外活性较高。结果表明,碳青霉烯类抗生素可作为临床治疗沙门菌病的首选药物之一。     

部分省市鸡白痢和鸡伤寒的单抗阻断ELISA血清学调查

采用单抗阻断ELISA法对我国部分省市不同品种、不同类型的鸡群进行了鸡白痢、鸡伤寒的血清流行病学调查。结果,在2309份鸡血清样品中检出阳性359份,阳性率为15.5%,不同鸡场鸡群感染率悬殊较大,从0到54.5%不等。表明,我国鸡群中鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌的流行呈现多样化。     

鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为研究sifA基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的sifA基因缺失株S06004ΔsifA,同时构建该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA),并对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性进行了研究。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了sifA基因缺失株S06004ΔsifA和该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA);生物学特性研究结果显示,sifA基因的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其对3日龄雏鸡的LD50升高了39.3倍。本研究获得的减毒鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株S06004ΔsifA为进一步研究鸡白痢沙门菌sifA基因的功能奠定了基础。     

鸡源唾液乳杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为筛选出对禽沙门菌具有显著拮抗效应的益生菌,从健康肉鸡消化道分离菌株,经细菌形态观察、生化试验鉴定及16S rDNA基因序列分析,共鉴定出14株唾液乳杆菌。体外琼脂扩散试验结果显示,WLS001、WLS002、WLS003、WLS004这4株分离株分别对鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌具有明显抑制作用。pH及胆盐耐受性试验结果表明,WLS001耐受性最强,在pH为2.0、胆盐浓度0.2%条件下均能生存。药敏结果显示,4株菌均对万古霉素耐药。安全性试验表明,所有唾液乳杆菌均没有溶血环,试验组雏鸡体重较对照组增重显著(P0.05)。组织病理切片显示,脾、肝、盲肠及十二指肠形态均正常。结果表明,4株鸡源唾液乳杆菌具有良好的生物学特性和安全性,具备进一步开发微生态制剂的潜力。     

不依赖RpoS的鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关基因鉴定

为鉴定鸡白痢沙门菌生物被膜形成不依赖Rpo S的调控基因,以鸡白痢沙门菌S6702及其rpoS基因缺失株S6702ΔrpoS为母本,对S6702生物被膜状态和S6702ΔrpoS生物被膜状态（S7BF vs S7SBF）及S6702ΔrpoS浮游状态和S6702ΔrpoS生物被膜状态（S7SFY vs S7SBF）进行转录组测序分析,筛选差异表达基因,构建基因缺失株并验证其生物被膜形成能力。结果显示,S7BF vs S7SBF组共鉴定出83个差异表达基因,S7SFY vs S7SBF组共鉴定出1 984个差异表达基因,筛选出15个可能与生物被膜形成相关的基因。以STM2361和STM1703为靶标构建基因缺失株,结晶紫染色定量结果显示,STM2361不影响鸡白痢沙门菌生物被膜的形成,而STM1703缺失能增强鸡白痢沙门菌的生物被膜形成能力。本研究鉴定出不依赖RpoS的鸡白痢沙门菌生物被膜形成调控基因,丰富了鸡白痢沙门菌生物被膜调控的信息。     

肉鸽都柏林沙门菌感染的检验与分析

沙门菌属(Salmonella)细菌的某些种(血清型) ,是引起禽类细菌性传染病的重要病原菌,在世界各地均有不同程度的暴发与流行,不仅影响禽的生长发育,降低其商品价值,甚至导致禽大批死亡,给养禽业造成严重的经济损失。在我国检出率较高的有鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和都柏林沙门菌等。笔者在禽病的研究工作中,对一起发生在肉鸽以纤维素性肺炎为主要特征病变的病例进行了检验,经对病原细菌分离、鉴定,确诊为由都柏林沙门菌所引起。1　发病情况与临床症状唐山某养殖户饲养的15 0只4 0日龄商品肉鸽突然发病,送检时已发…     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

取病死鸡肝接种于血清琼脂平板,挑取符合巴氏杆菌特征的单菌落进行纯化培养和染色镜检;对纯培养菌提取核酸,进行16S r RNA、kmt1和cap A基因的PCR鉴定,7个管家基因的PCR扩增和多位点序列分型,以及12个毒力基因的PCR检测;并进行分离菌的动物回归试验。结果显示,分离的2株病原菌(HN-1和CZ-6)均为两极浓染的革兰阴性短杆菌,16S r RNA和kmt1基因序列与多杀性巴氏杆菌的同源性均高于99%,荚膜血清型鉴定为A型,基因型为ST129型,除tox A、ptf A、nan H之外的9个毒力基因均被检出,动物回归试验表明分离菌对鸡的致病性较强。结果表明,这2株鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定为我国禽源菌株的遗传特性研究提供了一定参考。     

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiC突变株的构建与鉴定

为了研究spiC基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用同源重组方法构建该基因缺失株。以鸡白痢沙门菌S06004基因组DNA为模板,PCR扩增spiC基因上、下游DNA片段作为等位基因;将上游片段、卡那霉素抗性基因(KmR)及下游片段依次连接并克隆到pGMB151自杀性质粒上,构建重组自杀质粒pGMB151-ΔspiC/KmR,通过大肠杆菌χ7213与鸡白痢沙门菌S06004固相杂交,将质粒转入S06004中,运用反向筛选法获得含KmR基因的spiC基因缺失株(ΔspiC/KmR);再使用编码FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20敲除KmR,获得无抗性ΔspiC。PCR鉴定和测序结果显示,spiC基因被成功缺失。血清型、生化特性、生长特性、耐药性等鉴定表明,S06004ΔspiC未发生理化特性改变。本研究成功构建了spiC基因缺失株S06004ΔspiC,为进一步研究鸡白痢沙门菌致病性变化及spiC基因的功能奠定了重要基础。     

猕猴肠侵袭型大肠杆菌的分离鉴定及其毒力因子基因的检测

2010年5月从四川省某猕猴养殖场急性腹泻猕猴肠道内分离出4株致病性大肠杆菌,并对其进行了16SrDNA扩增、生化反应、血清型鉴定、药敏试验以及毒力因子基因的分子生物学检测。结果显示,该菌株血清型为O28;药敏试验证实该菌对多种抗生素具有抗性,并且呈现多重耐药性;攻毒试验证实该菌能够导致小白鼠大量死亡;多重PCR成功检测出侵袭性大肠杆菌的Einv毒力基因。确定该病原菌为肠侵袭型大肠杆菌,而且毒力很强。     

山羊源志贺菌的分离鉴定及其部分生物学特性的研究

对采集自四川部分地区的226份羔羊粪便样本进行志贺菌的分离鉴定,同时对分离菌株进行血清型鉴定,并用PCR检测其携带sat、sen、set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A、ipa H共10个毒力基因的情况;采用灌胃法检测携带毒力基因最多的4株优势血清型菌株培养物对BALB/c小鼠的致病力。经细菌分离鉴定,从226份样本中共分离到54株志贺菌;血清型鉴定结果显示,4株的血清型为福氏志贺菌1a型,11株的血清型为福氏志贺菌1b型,28株的血清型为福氏志贺菌2b型,11株的血清型为福氏志贺菌3b型。54株志贺菌均携带sat、sen、ipa H基因,而set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A基因的阳性携带率分别为73.6%、65.2%、77.8%、82.0%、79.1%、79.1%,每个菌株携带4~10种毒力基因。携带10个毒力基因的4株福氏志贺菌2b型优势血清型菌株均在1.7×108CFU/m L剂量下致死全部试验小鼠,其中福氏志贺菌SWUN553对BALB/c小鼠的LD50为1.04×106CFU;致死小鼠的组织病理学检查显示,心、肝、脾、肺、结肠出现明显的坏死与炎性细胞浸润等病变,提示结肠为该菌入侵的最有可能部位。本研究阐明了山羊源志贺菌的部分生物学特性,为山羊志贺菌病的防控提供了科学依据。     

鼠伤寒沙门菌双缺失株SL1344ΔcrpΔsipB的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗候选株,在单缺失株SL1344Δcrp的基础上,运用自杀性质粒介导的细菌同源重组技术敲除sipB基因,构建了双缺失株SL1344ΔcrpΔsipB。PCR及测序结果表明SL1344ΔcrpΔsipB构建成功。生物学特性研究表明,SL1344ΔcrpΔsipB血清型未发生变化,遗传性稳定。与亲本株SL1344相比,双缺失株的生长速度明显减慢,毒力降低了约99.9%以上。免疫保护效力试验显示,6周龄昆明小鼠口服免疫SL1344ΔcrpΔsipB后第17天,利用鼠伤寒沙门菌野生株攻毒,保护率为60%;免疫后第21天血清抗体效价达到峰值。上述结果为进一步研制安全有效的鼠伤寒沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。     

鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp的构建及鉴定

为研制安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒株,首先利用自杀质粒介导的同源重组技术构建鸡伤寒沙门菌1009株的spic基因缺失株1009Δspic,在此基础上,运用λ噬菌体同源重组系统进一步敲除crp基因,以构建鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建出双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。生物学特性研究结果显示,1009株spic和crp基因的缺失能够得到稳定的遗传,部分生化特性发生了变化,生长速度较缓慢,对雏鸡的LD50升高了107倍。本研究获得的高度安全的鸡伤寒沙门菌减毒株为进一步研制鸡伤寒沙门菌减毒疫苗奠定了基础。     

hmpA基因对鸡白痢沙门菌在巨噬细胞内生存影响的研究

为了探究hmpA基因对鸡白痢沙门菌在胞内生存的影响,本研究利用同源重组方法构建了鸡白痢沙门菌449/87的hmpA基因缺失株(449/87△hmpA),同时利用原核表达载体pMMB207构建了基因回复株449/87△hmpA∷hmpA,并对其生长曲线、生化特性以及其感染鸡源巨噬细胞HD11后一氧化氮合酶(NOS)活性、...     

鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为了探究5'-nucleotidase基因的功能及其在鼠伤寒沙门菌感染中的作用,本研究首先构建缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因的重组自杀性质粒pR E 112Δ5'-nucleotidase,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344Δ5'-nucleotidase缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。PCR及测序结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase构建成功,且回复株SL1344CΔ5'-nucleotidase构建成功。进一步研究表明,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因,生长速度没有发生明显改变。但是,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为4.30×10~7CF U,毒力降低至亲本株SL1344的1.96%。免疫保护率试验结果显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。缺失株免疫小鼠后第21天,血清抗体IgG水平达到最高。回复菌株与亲本亲株之间生物学特性无显著性差异,基本恢复到野生型水平。上述结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因与其致病力之间的关系提供了依据,并为研究它在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定了基础。     

广东省发病猪禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分布

为了解广东省发病猪、禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛(HPI)的分布和HPI阳性菌的血清型,从广东省发病的猪、禽养殖场共分离鉴定了608株大肠杆菌,针对耶尔森菌强毒力岛的标志基因irp2基因设计1对引物,对这些大肠杆菌进行了irp2基因的PCR检测;并对HPI阳性菌进行O血清型鉴定。结果显示,有105株菌含有irp2基因,即HPI阳性率为17.27%(105/608)。猪源、鹅源、鸽源、鸡源、鸭源、鹧鸪源大肠杆菌的HPI检出率分别是16.51%、17.81%、21.05%、17.74%、19.01%及0;105株HPI阳性菌的血清型分布较为分散,没有明显规律;主要的血清型有O1、O26、O45、O114、O136、O18等。研究表明,广东省猪、禽养殖场大肠杆菌的HPI携带率较高,血清型复杂。     

四川部分区域鸽源沙门菌携带情况的调查及其部分生物学特性的分析

为了解四川部分区域鸽源沙门菌的病原携带情况及分离菌的部分生物学特性,笔者采用RTPCR对四川部分区域采集的1 375羽赛鸽、信鸽的肛门拭子、粪便样本开展了沙门菌携带情况的调查,检测分离鉴定得到的沙门菌部分毒力基因。结果鉴定出52株沙门菌,检出率为3.85%(95%置信区间为2.81%～4.85%),以双流区、郫都检出率较高,分别为11.23%(9/81)和11.11%(10/89),各区域间检出率差异极显著(P0.01)。甲型副伤寒沙门菌、纽波特沙门菌均占定型菌株的11.9%,定型菌毒力基因sipC占比为92.85%,提示分离株有较强的入侵非吞噬细胞的能力。结果丰富了鸽源沙门菌携带情况的相关资料,为鸽源沙门菌的深入研究及防控提供了参考。     

食品动物源沙门菌fosA_3基因的流行及传播特征

为研究质粒介导的磷霉素耐药基因fosA_3在食品动物源沙门菌中的流行状况及传播特征,采用PCR方法对本实验室保存的288株动物源沙门菌进行磷霉素耐药基因fosA_3、fosA和fosC2的检测,用琼脂稀释法测定阳性菌株对17种抗生素的敏感性,PCR检测其他相关耐药基因,玻片凝集法确定其血清型。采用脉冲场凝胶电泳(PFG E)和多位点序列分型(M LST)分析菌株间的亲缘关系。采用接合转移/转化、复制子分型、S1-PFGE和Southern杂交等对fosA_3的水平传播和质粒特征进行分析。结果显示,共筛选得到6株(2.1%)fosA_3阳性沙门菌,没有检测到fosA和fosC2。6株fosA_3阳性菌均表现出多重耐药,且同时携带blaCTX-M-9G(均为blaCTX-M-14)基因和floR基因,血清型检测均为印第安纳型。6株菌均为MLST(ST)17型,PFGE结果显示其图谱相似。质粒分析结果显示,fosA_3能通过IncN或IncA/C型质粒与blaCTX-M基因发生共同转移。本研究首次从国内不同地区采集的鸡粪便拭子样本中分离得到的沙门菌中检测到fosA_3基因,菌株的克隆传播和fosA_3与blaCTX-M随质粒的水平传播都加速了耐药性的散播,对公共卫生构成潜在威胁。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株分泌性蛋白K1缺失株的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)疫苗弱毒株,本研究首先构建了含缺失1 011 bp sseK1基因的重组自杀性质粒PREΔsseK1,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的sseK1缺失株。PCR、双酶切及测序结果表明SL1344ΔsseK1构建成功。生物学特性初步研究表明,与亲本菌株SL1344相比,缺失株SL1344ΔsseK1保留了亲本株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失后的sseK1基因,生长速度及生化特性没有发生明显改变。小鼠毒力试验表明,SL1344ΔsseK1缺失株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD_(50)为6.63×10~8CFU,毒力较亲本株SL1344下降至0.048%。免疫保护效力试验显示,小鼠免疫后第14天血清抗体Ig G含量达到最高,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率。以上研究结果表明,SL1344株sseK1基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为研究sseK1基因的致病机制及将其开发为更加安全有效的沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定了基础。