猪丁型冠状病毒TaqMan实时定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中登录的猪丁型冠状病毒(PDCoV)N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针,构建含有PDCoVN基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验。结果显示,该方法仅对PDCoV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与2.2×10~9~2.2×10~1copies/L之间的质粒浓度具有良好的线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.539×lg X+38.95,线性相关系数(R2)为1.0,检测下限为2.2 copies/L。对3个不同浓度(2.2×10~2、2.2×10~4、2.2×10~6copies/L)的pMD18-PDCoV-N进行2次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.0%,表明该方法具有良好的重复性。应用建立的方法对64份广西临床腹泻样品进行检测,结果从其中18份样品中检出PDCo V,样品阳性率为28.1%,说明广西猪群存在PDCoV感染。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法为PDCoV的检测和定量分析提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

猪δ冠状病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

为了快速准确地检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),本研究根据PDCoV基因序列保守区设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了一种特异性检测PDCoV的TaqMan-MGB荧光定量方法。结果显示,该方法特异性良好,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型等的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在3.15×108～3.15×101copies/?L范围内具有良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为10 copies/?L的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.25%～1.06%和0.58%～1.27%;对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量检测方法对PDCoV的阳性检出率(40%)高于常规PCR方法对PDCoV的阳性检出率(31.7%)。该方法的建立为PDCoV的实验室鉴别诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

猪乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×10¹～7.2×10⁸ copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×10⁰copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。     

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立及初步应用

自2014年美国首次报道猪Delta冠状病毒(PDCoV)以来,该病毒相继在我国一些猪场检测到,由于其发病症状和病理剖检与猪流行性腹泻(PED)极其相似,且易出现混合感染,临床很难区分,给养殖业造成严重经济损失,因此建立能够同时检测且能区分这两种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PDCoV和猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因序列,设计了2对分别用于扩增PDCoV N基因和PEDV M基因的目的片段的引物,通过对RT-PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PDCoV和PEDV的双重RT-PCR检测方法,并对该方法进行了灵敏性、特异性和重复性研究。结果显示,该双重RT-PCR对PD-CoV和PEDV的最低检测量分别是3.14×10~3 copies/μL和3.88×10~4 copies/μL。该方法仅对PDCoV和PEDV检测为阳性,对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、博卡病毒(PBoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病毒(PRV)等猪常见的感染病毒的扩增均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。用建立的双重RT-PCR方法对111份临床样品进行检测,其中PDCoV阳性样品22份,阳性率为19.82%,PEDV阳性样品27份,阳性率为24.32%,PDCoV和PEDV共感染的样品数为10份,阳性率为9.01%。本试验所建立的双重RT-PCR方法能够快速、准确地对PDCoV和PEDV单一或混合感染的临床样品进行快速检测,为临床上对PDCoV和PEDV鉴别诊断和流行病学调查研究提供了新的技术手段。     

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒猪Delta冠状病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)基因序列,分别设计特异性引物,扩增PEDV N基因(750 bp)、TGEV M基因(544 bp)、PDCoV N基因(183 bp)和PRoV VP6基因(329 bp)。经过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化及特异性、敏感性、重复性试验,成功建立了快速鉴别检测PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法仅对PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV检测为阳性,对口蹄疫病毒(FMDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)等主要病毒的扩增均为阴性。PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV重组质粒标准品的检出下限分别为1.57×10~2、1.57×10~3、1.57×10~2、1.57×10~2copies/L。相同条件下的重复性试验获得均匀一致的结果。应用所建立的方法检测2017—2018年采集自广西各地的270份腹泻病料,结果显示,PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的阳性率分别为15.56%、11.48%、10.74%、1.85%,并且存在混合感染现象。上述结果表明,所建立的多重RT-PCR方法可用于PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的快速鉴别检测及流行病学调查。     

猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoV M基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10~8～6.57×10~1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10~1copies/μL;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。     

PDCoV和PEAV二重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻症状为主,症状相似,临床上难以快速诊断。为建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法,本研究根据PDCoV和PEAV N基因序列,分别设计2对特异性引物,以阳性质粒为模板,对二重RT-PCR反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性试验。结果显示,所建立的方法能够扩增出PDCoV和PEAV的特异性片段,大小分别为690 bp和208 bp,且对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)无扩增条带;对PDCoV和PEAV的最低检测量分别为5.13×102copies/μL、4.73×101copies/μL。对60份临床腹泻样本病料进行检测,结果PDCoV的检出率为21.6%,未检测出PEAV。本研究所建立的二重RT-PCR方法可用于临床流行病学监测,为快速诊断PDCoV和PEAV提供理论依据和技术支持。     

水禽3种免疫抑制性病毒多重PCR检测方法的建立与应用

禽流感病毒 H9 亚型(AIV-H9)、鹅圆环病毒(GoCV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)是水禽常见病原,常发生混合感染且易导致水禽的免疫抑制性疾病。 本研究针对 AIV-H9、GoCV 和 MDRV 的基因序列,分别设计特异性引物,通过优化多重 PCR 的反应条件,建立了这 3 种病毒的多重 PCR 检测方法,并进行特异性、灵敏度和可重复性验证。 结果显示,建立的三重 PCR 检测方法能特异性扩增 AIV-H9、GoCV 和 MDRV的目的片段,与新型鹅星状病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽腺病毒 4 型无交叉反应;最低检出浓度分别为2.93×10⁴copies/ μL、2.5×10²copies/ μL、3.0×10⁶copies/ μL;利用该方法对 30 份临床样品进行检测,MDRV检出率为 6.7%,GoCV 和 AIV-H9 的检出率较高,分别为 36.7%和 26.7%。 三重 PCR 与单重 PCR 的符合率为 100%。 结果表明,该三重 PCR 检测方法特异、灵敏、稳定性好,能够用于这 3 种病毒的流行病...     

猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已公布的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)N基因序列设计并合成特异的引物和TaqMan探针,构建质粒标准品,以标准品为模板建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪库布病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和口蹄疫病毒为模板时均未检测到荧光信号,表明该方法具有良好的特异性;用2.66×10~6、2.66×10~5和2.66×10~4copies/L这3个不同浓度的质粒标准品进重复试验,循环阈值Ct的变异系数均低于2%,表明该方法具有良好的特异性;标准曲线斜率为-3.461,相关系数为R~2=0.998,表明阈值和模板浓度之间具有良好的线性关系。10倍梯度稀释质粒标准品,检测的最低限度为2.66×10~1 copies/L的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对194份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示PDCoV阳性率为22.1%,明显高于常规RT-PCR的11.9%,表明该方法可应用于PDCoV的临床诊断及定量检测。     

牛病毒性呼吸道疾病主要病原多重PCR检测方法的建立与应用

为建立对牛呼吸道疾病综合征(BRDC)进行快速而准确的病原学检测方法,基于牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)g B 基因、牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 5′UTR 基因、牛副流感病毒 3 型(BPIV3)HN 基因和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV) N 基因设计检测引物,经过条件优化,建立了检测 IBRV、BVDV、BPIV3 和 BRSV的多重 PCR 方法。 该方法具有良好的特异性和灵敏性,可特异性地同时检测 IBRV、BPIV3、BRSV 和 BVDV,灵敏度分别为 5.86×10³、2.42×10³、1.02×10⁴和 5.02×10⁴copies/ μL,且重复性良好。 利用该方法对采集的309 份具有呼吸道症状牛的鼻腔拭子进行检测 ,结果显示 ,IBRV、BVDV、BPIV3 和 BRSV 的阳性率分别为6.15%、28.16%、18.12%和 33.66%,其中 BVDV 与 BRSV 的混合感染率为 5.18%,BVDV 与 BPIV3 的混合感染率为 1.62%,BRSV 与 BPIV...     

副流感病毒5型RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了精准和快速检测副流感病毒5型(PIV5),本研究下载NCBI中发布的不同物种来源的25株PIV5全基因序列,对比后选择高度保守的NP基因序列区段设计特异性引物,建立了检测PIV5的RT-PCR方法。结果显示,建立的方法具有较强的敏感性和特异性,可扩增出115 bp大小的片段。敏感性结果显示,核酸最低检测量为7.93×10⁵copies/μL,与牛副流感3型病毒等8种临床常见病毒均无交叉反应。分别采集猪、牛及犬的临床样品共40份进行检测,阳性率为20%,表明建立的RT-PCR方法可用于临床上副流感病毒的检测。     

中蜂囊状幼虫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立与应用

通过RT-PCR方法在云南中华蜜蜂体内检测中蜂囊状幼虫病毒(CSBV),该病毒主要以AmSBV-YN(GenBank ID:KX819276.1)病毒株的形式存在。为了精确鉴定、快速检测中蜂囊状幼虫病毒,根据AmSBV-YN的CDS保守区域,设计合成特异性引物并建立相对应的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的标准曲线循环域值(C_t)与标准品模板浓度在2.34×10²～2.34×10⁹copies/μL间的线性关系良好,相关系数R²为0.994,斜率为-3.118。该方法与蜜蜂残翅病毒、黑蜂王台病毒、蜜蜂以色列急性麻痹病毒不发生交叉反应,表明该方法特异性强;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于3%。所建立的荧光定量PCR方法对中华蜜蜂样品的检测结果显示,阳性率达90.0%,高于常规PCR方法的检测阳性率73.3%,说明该方法具有良好的适用性。结果表明,该方法可应用于对中蜂囊状幼虫病毒的快速检测,为中蜂囊状幼虫病的及时防控提供了有力的技术支持。     

猪库布病毒纳米PCR快速检测方法的建立

为了给临床检测猪库布病毒(PKV)提供更加准确便捷的检测方法,本试验设计了1对特异性引物,扩增PKV基因组的VP0区域。在传统PCR反应体系中添加纳米金颗粒材料,优化后建立了一种方便快捷且特异检测PKV的nano-PCR方法。结果显示,该方法能特异性扩增猪库布病毒,与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒均无交叉反应。nano-PCR相对于普通PCR表现出更高的敏感性,普通PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-7ng/μL,而nano-PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-10ng/μL,敏感性提高了1 000倍。对来自不同发病猪场30份腹泻猪的粪便和血液临床样本的检测结果显示,nano-PCR阳性检出率为23.33%(7/30),普通PCR阳性检出率为16.66%(5/30)。结果表明,本试验建立的nano-PCR方法在猪库布病毒的检测中表现出更高的特异性和敏感性,对猪库布病毒的快速诊断和检测具有重要的临床意义。     

猪凸隆病毒猪嵴病毒猪捷申病毒猪轮状病毒多重荧光RT-PCR方法的建立与初步应用

为建立一种同时检测猪凸隆病毒、猪嵴病毒、猪捷申病毒和猪轮状病毒的高特异性、高灵敏性的检测方法,根据这4种病毒的保守基因序列分别合成相应的特异性引物及TaqMan探针,采用One-Step法进行反应体系的优化,建立多重荧光RT-PCR方法,评估该方法的特异性、敏感性、重复性,并用于本地猪场腹泻样品中上述4种病毒的流行病学调查。结果显示：该方法特异性好,可特异性地检测上述4种病毒的单一模板及混合模板,其他对照株均无扩增信号;灵敏度高,上述4种病毒的最低检出限均为10¹ copies/μL;重复性好,批内及批间重复试验变异系数均小于3%。所建立方法还具有高通量、低污染和操作简便的优点,3 h内即完成全市猪场265份腹泻样品的检测,大大提高了检测效率。流行病学调查显示,厦门市养猪场猪嵴病毒、猪捷申病毒、猪轮状病毒和猪凸隆病毒这4种病毒均具有较高的检出率,阳性率依次为67.92%、65.28%、36.60%和27.55%。该研究将为猪腹泻病鉴别诊断及防控提供重要的技术支持。     

猪链球菌1/2型的分离鉴定与致病性研究

为精准鉴定从贵州临床发病死亡猪分离到的疑似致病菌,通过形态学观察、革兰染色镜检、生化鉴定、种特异性PCR鉴定、血清型分型鉴定及毒力基因、小鼠致病性、耐药性检测,确定分离菌株为血清型1/2型猪链球菌,携带fbps⁺、mrp⁺、orf2⁺毒力基因,不具有gapdh、sly毒力基因,小鼠LD₅₀为2.0×10⁹CFU/m L,致病小鼠肺和肝可见明显病变,对氨基糖苷类、喹诺酮类、氯霉素类和大环内酯类等多种抗生素敏感。结果表明,贵州省猪群存在致病性猪链球菌1/2型感染。     

禽多瘤病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)的快速诊断方法,根据APV VP4基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,验证了其特异性、敏感性和重复性,并利用建立的方法对采集的临床样本组织进行检测。结果显示,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1.0×10⁹～1.0×10²copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.021,检测下限为1.0×10¹copies/μL,与其他禽源病毒未发生交叉反应,重复性试验的变异系数均小于2%,重复性好,并且该方法在实际临床检测中可行。上述结果表明,建立的方法可用于禽多瘤病的早期诊断和APV快速检测。     

猪圆环病毒2型及猪细小病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒2型(PPV2)均为猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的潜在致病病原。为了建立一种高效、快速、准确且能够同时鉴定PCV2和PPV2的双重PCR方法,下载GenBank已公布的多个PCV2及PPV2全基因序列并比对,针对PCV2和PPV2基因组的保守序列设计合成2对PCR引物,对双重PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PCV2和PPV2的双重PCR方法,并对其敏感性,特异性及与普通单一PCR的符合率做出评价。结果显示,该方法能同时扩增出666 bp(PCV2)与254 bp(PPV2)的特异性片段,对阳性标准质粒pMD-PCV2和pMD-PPV2的检测限分别为1.0×10²copies/μL和1.0×10¹copies/μL,对猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒1/4/6/7型和猪圆环病毒3/4型的核酸扩增结果均为阴性。对临床疑似患PRDC的86份肺部组织样品进行检测,结果显示,PCV2阳性率为30.2%,PPV2阳性...     

猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的方法,本研究根据GenBank上登录的FHV-1 UL55序列设计特异性探针及引物,筛选最佳引物对,建立了FHV-1的重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。该方法在39℃反应20 min即可快速、特异性地检测FHV-1。灵敏性试验结果显示,RAA最低检测限为7.60×10¹ copies/μL,比普通PCR最低检测限高100倍。特异性试验结果显示,该RAA方法与猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫细小病毒无交叉反应。对34份临床样本进行检测,其中13份为阳性,阳性检出率为38.23%。综上所述,本研究成功建立了猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法。     

猪丁型冠状病毒可视化LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种简单、快捷,适用于基层检测猪丁型冠状病毒(PDCoV)的方法,根据GenBank上登录的PDCoV N基因的保守序列设计了1组环介导等温扩增(LAMP)引物,以重组质粒pMD19-T-N为模板、羟基萘酚蓝为显色剂,优化反应条件及体系,并检测该方法的特异性及灵敏度.结果 显示,该方法与猪流行性腹泻病毒、猪博卡病...