PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原优势区基因真核表达质粒的构建及其免疫效果

采用PCR法扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2抗原优势区(ORF2′)基因和猪细小病毒(PPV)VP2基因,将目的基因定向插入真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2′-VP2。将重组质粒免疫小鼠,同时设立PCV亚单位疫苗、PPV灭活疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,PCV2和PPVIgG抗体效价进行了检测。结果表明,从免疫后第7d起,pCI-ORF2′-VP2免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和抗PCV2、PPV的特异性抗体效价都显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于空载体对照组,且重组质粒组在第21～42d诱导的免疫水平显著或极显著强于PPV灭活疫苗组。证实,构建的重组质粒pCI-ORF2′-VP2能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

联合表达PPV VP2和PCV2 ORF2基因的重组PRV的构建

将包含有完整阅读框架的PPV VP2基因(1 740 bp)和PCV2 ORF2基因(750 bp)插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.采用脂质体介导法将重组质粒的DNA和PRV SA215株的DNA共转染Vero细胞,转染后20 h出现带荧光的空斑,挑斑纯化后繁殖,并收获病毒液.PCR和免疫荧光试验结果证实,成功构建了重组病毒,将其命名为PRV SA215(D1)株.细胞培养特性试验结果显示,重组病毒可以在Vero、MDBK、ST和IBRS-2等多种细胞上增殖,在Vero细胞上的增殖效价为1×106PFU.分别以1×106PFU/头、1×104PFU/头剂量接种28日龄仔猪,结果显示,免疫仔猪的PPV、PCV2抗体水平均逐渐升高,并分别从接种后第14 d和21 d开始,PPV、PCV2抗体转为阳性.此结果进一步佐证了重组PRV SA215(D1)株已构建成功.     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位重组腺病毒的免疫保护性研究

为了评估联合表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因和具有免疫原性的T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE的免疫保护效果,将20头抗体和核酸均为阴性的断奶仔猪随机分为4组,包括2组免疫组、攻毒对照组和阴性对照组。2组免疫组分别免疫重组腺病毒rAd-ORF2-TCE和rAd-ORF2,2周后加强免疫1次,一免后第28天攻毒。通过PCV2特异性抗体水平的检测以及血清中和试验评估疫苗的体液免疫反应水平,通过外周血T淋巴细胞亚群的动态变化以及细胞因子分泌水平评估疫苗免疫诱导的细胞免疫反应水平。结果表明,与其他对照组比较,重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够诱导猪体产生更为强大的体液免疫和细胞免疫水平。攻毒试验结果表明,rAd-ORF2-TCE能够有效抵抗PCV2感染。本试验结果进一步证实了构建的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够有效地诱导猪产生足够的免疫保护能力。     

犬细小病毒2b亚型VP2基因的克隆及其B细胞抗原表位分析

对犬细小病毒2b亚型衣壳蛋白VP2基因进行了克隆、测序,并用分子生物学软件DNAStar对VP2基因的推导氨基酸序列进行了表位分析。结果显示,获得了犬细小病毒2b亚型的VP2基因,序列全长1 755 bp,编码584个氨基酸;B细胞表位主要位于VP2蛋白第1~38、73~83、86~104、152~195、235~243、294~326、347~400、404~416、469~483、503~521和571~585区段。表明,犬细小病毒2b亚型VP2蛋白上分布有多个B细胞抗原表位,这为犬细小病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达及ELISA检测方法的建立

采用PCR扩增了猪圆环病毒Ⅱ型广东分离株的ORF2 3'端基因,将其连接到pET32a(+)质粒上并转化DH5a细胞,重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化BL21菌,用1 mmol/L IPTG诱导表达重组菌.经sDS-PAGE和Western-blot分析,表明ORF2基因已在大肠杆菌中正确表达,表达的融合蛋白的分子质量约为33 ku;表达产物经超声波处理后,用Ni-NTA柱纯化,复性,用此纯化产物包被酶标板,建立了ELISA诊断方法,经对临床516份血清样品进行检测,结果表明仔猪的血清阳性率为35.2%,育肥猪的血清阳性率为60.6%,种猪的血清阳性率为69.8%.     

猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV-2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析,结果表明,克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92.0%~93.3%,推导氨基酸序列的同源性为82.9%~84.6%。重组质粒pMD18-T-ORF2经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES,成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。     

鹅细小病毒VP2基因原核及真核表达载体的构建

将鹅细小病毒VP2基因克隆到原核表达载体 pPROEX HTb及真核转移载体pFASTBAC HTb中 ,重组真核转移载体在DH10BAC 中经转座作用 ,成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX HTb VP2和杆状病毒表达载体BAC VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析 ,确定为阳性重组子     

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )的ORF1基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,对PCV 2广东株 (GD)ORF1基因进行PCR扩增 ,将扩增的ORF1基因克隆入 pMD 18 T载体 ,获得的重组质粒命名为 pMD ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD/ gⅢC得到重组子 ,命名为 pBAD/ gⅢ ORF1。序列分析表明 ,克隆的ORF1与德国分离株AF2 0 1897核苷酸序列的同源性高达 99.5 % ;与其他PCV 2株的核苷酸序列同源性为 92 .1%～99.9% ,推导的氨基酸序列同源性为 90 .2 %～ 99.5 %。同时 ,测序结果表明 ,克隆的ORF1准确插入了 pBAD/ gⅢC的多克隆位点 ,未改变读码框。用L 阿拉伯糖诱导表达 ,收集菌液进行SDS PAGE和Western blotting分析 ,结果表明PCV 2ORF1在pBAD/ gⅢC中获得了高效融合表达 ,其表达蛋白的分子质量约为 4 1ku。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位区与猪细小病毒VP2真核表达质粒的构建及免疫效果

筛选了3个位于流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白上不同位置的抗原表位区基因,利用重叠PCR方法分别与猪细小病毒(PPV)VP2基因相连。将目的基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pcDNA3.1-EA-VP2、pcDNA3.1-EB-VP2、pcDNA3.1-EC-VP2。将重组质粒在无免疫佐剂参与的情况下免疫BALB/c小鼠,同时设空质粒接种组及PBS缓冲液接种组作为空白对照,采用ELISA法、淋巴细胞增殖试验和流式细胞仪技术分别对抗体水平、脾淋巴细胞转化功能和小鼠外周血中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞数进行检测。结果显示,重组质粒pcDNA3.1-EA-VP2、pcDNA3.1-EB-VP2、pcDNA3.1-EC-VP2接种小鼠后,都能诱导小鼠产生JEV、PPV特异性抗体,并且促进脾淋巴细胞增殖。试验组与对照组比较差异极显著(P0.01);试验组小鼠CD3+、CD4+T淋巴细胞数在首疫后第7天高于对照组(P0.01),CD8+T淋巴细胞数在首免后第14天高于对照组(P0.01)。pcDNA3.1-EB-VP2免疫组小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平均高于pcDNA3.1-EA-VP2和pcDNA3.1-EC-VP2免疫组。表明,用JEV E蛋白抗原表位区基因与PPV VP2基因构建的真核表达质粒能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

猪2型圆环病毒广东株ORF2基因在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR扩增猪 2型圆环病毒广东株ORF2后部一段基因 ,将PCR产物用KpnⅠ和HindⅢ酶切后与同样处理过的 pBAD/gⅢB载体连接 ,转化TOP1 0细胞后挑取阳性克隆 ,酶切鉴定和测序后 ,用L 阿拉伯糖诱导 ,经SDS PAGE和Western blotting分析 ,表明ORF2基因在大肠埃希氏菌中得到了表达 ,表达的多肽为 2 8ku。     

两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2,并对其进行了测序与分析。结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97.3%~99.9%,与PCV2 ORF2基因的同源性为67.9%~68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明,PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。     

猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪伪狂犬病病毒(PRV)gD和猪细小病毒(PPV)VP2基因保守区域,设计了特异性引物,在分别建立单一病毒基因PCR检测方法的基础上,通过对3组引物的比例和浓度、dNTPs和Mg2 浓度、退火温度等条件的优化,建立了针对上述3种病毒的三重PCR检测方法。敏感性试验表明,应用该方法最低可检测到4×10-4ng/μL的PRV双链DNA模板和2×10-5ng/μL的PCV2和PPV单链DNA模板。对21份自然感染病猪样品的检测结果表明,该三重PCR检测结果与单一PCR检测的结果完全符合。试验结果显示,建立的三重PCR方法可用于3种DNA病毒的同时检测,具有快速、准确的特点,有临床应用前景。     

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

为进一步研究猪圆环病毒2型(PCV2)的致病机制和基因功能,利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列,将其定向克隆入pEGFP-N1载体,成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2.将该质粒转染PK-15细胞并连续盲传5代,用PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV2核酸;间接免疫荧光可以检测到绿色荧光,表明有PCV2抗原存在.证明构建的双拷贝重组质粒具有感染性.