结核分枝杆菌rv3295基因的原核表达及单克隆抗体的制备

以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增了rv3295基因;将其克隆至表达载体pET-22b中,构建了重组质粒pET-22b-Rv3295;将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达出了Rv3295蛋白。通过亲和层析纯化,以该重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合筛选制备抗该重组蛋白的单克隆抗体;采用Western-blot验证单克隆抗体的特异性;通过亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型。结果显示,Rv3295蛋白以可溶形式表达,蛋白质的分子质量大小为25ku。获得1株抗该重组蛋白的单克隆抗体1F7,其亚型为IgG1/κ;Western-blot结果显示,该抗体具有较好的特异性。本研究制备的Rv3295蛋白的单克隆抗体对于研究Rv3295蛋白的功能及其与DNA之间的互作奠定了基础。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合基因的表达及其多克隆抗体的制备

以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组DNA为模板,经重叠PCR扩增获得CFP10-ESAT-6融合基因片段,克隆于pET21a表达载体中,获得了重组质粒pET21a-CFP10-ESAT-6,将其转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达,得到了25 ku的目的蛋白。表达产物经纯化和定量分析后免疫新西兰大白兔,收集兔血清进行抗体ELISA检测。结果显示,成功构建了CFP10-ESAT-6融合基因的原核表达质粒,获得了CFP10-ESAT-6融合蛋白,以此蛋白免疫动物可产生高效价的抗体。     

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。     

扬子鳄Mx基因的原核表达和纯化及其多克隆抗体的制备

扬子鳄Mx以蛋白质的形式发挥其抗病毒功能,本试验通过构建pET28a-Mx质粒,将其转化入大肠杆菌感受态细胞中,用IPTG诱导其进行蛋白大量表达,并纯化蛋白。将纯化好的蛋白作为抗原,与弗氏佐剂充分乳化,免疫6周龄的BALB/c雌性小鼠,4次免疫后提取其血清,测定效价。应用Western-blot检测制备的鼠抗扬子鳄Mx多克隆抗体的特异性。结果显示,扬子鳄Mx蛋白原核表达载体构建成功,并且应用切胶纯化的方式成功纯化了该蛋白。制备的鼠抗扬子鳄Mx多克隆抗体的效价达1∶51 200以上。本试验研究结果为进一步研究扬子鳄Mx蛋白的抗病毒功能提供了物质条件。     

鹅IL-18基因的克隆和原核表达及其多克隆抗体的制备

参考GenBank中鸡、火鸡和鸭IL-18基因序列,设计了1对特异引物,以提取的鹅脾细胞总RNA为模板,应用RT-PCR扩增、克隆鹅IL-18基因中间的333bp序列。序列分析结果表明,其与鸭IL-18基因对应序列相似性最高,达99%。参考鸭IL-18全基因序列设计上、下游引物各3条,以梯度PCR探索扩增、克隆鹅IL-18全基因。以上述策略成功扩增、克隆了3个广东地方杂交品种鹅的IL-18基因。序列分析表明,这3个杂交品种鹅的IL-18基因序列一致,长642bp,含一个603bp的ORF,编码200个氨基酸,分子质量为23.2ku。ORFN端的30个氨基酸为前导序列,其余170个氨基酸为功能蛋白序列。在GenBank中注册了第一条鹅的IL-18基因序列,登录号为EF159728。随后,构建了鹅IL-18基因ORF的重组原核表达质粒pET-GIL-18,经诱导表达、纯化获得重组鹅IL-18融合蛋白,并以其制备了兔抗重组鹅IL-18多克隆抗体。     

西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。     

大肠杆菌多重耐药调控基因rob的原核表达及其表达蛋白多克隆抗体的制备

提取阳性克隆质粒pMD18-T-rob,经SacⅠ+XhoⅠ双酶切,回收目的片段,定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体中,提取阳性质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,收集表达产物,SDS-PAGE分析证实pET-28a-rob可成功地在大肠杆菌中表达出Rob蛋白。Western-blot分析证明,Rob蛋白具有良好的反应原性。表达出的Rob蛋白经侧带法纯化后免疫獭兔3次,制备抗Rob蛋白的多克隆抗体。通过间接ELISA方法检测抗体效价,结果表明抗体血清1∶40稀释时抗体效价较高。     

帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达.采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-bl...     

结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析

以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。     

猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备

通过构建pGH基因的原核表达质粒,转化大肠埃希氏菌TOP10,经IPTG诱导,成功表达了重组猪生长激素的融合蛋白。经SDS PAGE分析,在分子质量50.4ku处有1条新的特异蛋白质条带。对以包涵体形式表达的融合蛋白进行SDS PAGE分离,并经透析得到了重组融合蛋白,以此融合蛋白免疫家兔,制备并纯化了抗pGH多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测,此抗体具有较高效价和特异性。成功地表达了pGH基因并获得了多克隆抗体。     

伊氏锥虫PFR2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为了探究伊氏锥虫副鞭毛杆蛋白2(paraflagellar rod protein 2,PFR2)的分子特征和免疫特征,利用PCR扩增伊氏锥虫PFR2基因,将扩增产物插入p QE-80L载体,经原核表达后,将纯化后的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,利用Western-blot鉴定反应原性。结果表明,PFR2基因大小为1 803 bp,编码含601个氨基酸残基的蛋白质,SDS-PAGE电泳显示该蛋白大小约为66 ku,主要以包涵体的形式表达。用间接ELISA方法检测小鼠抗PFR2多克隆抗体的效价为1∶25 600;Western-blot检测显示重组PFR2蛋白具有较好的反应原性。本研究为进一步研究伊氏锥虫PFR2蛋白的功能奠定了基础。     

扬子鳄α型干扰素蛋白的原核表达和纯化及其多克隆抗体的制备

为了进一步研究扬子鳄IFN-α,构建原核表达载体pET32a-IFN,导入大肠杆菌表达系统后诱导表达,并纯化靶蛋白.使用纯化重组蛋白作为抗原,加入佐剂乳化后免疫3只雌性的6周龄BALB/c小鼠,免疫后第35天对小鼠采血分离血清并测定效价.结果显示,成功构建原核表达载体pET32a-IFN,Western-blot鉴定显...     

猪急性腹泻综合征冠状病毒膜蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)抗膜蛋白(M)多克隆抗体,本研究以SADS-CoV GDS04分离株cDNA为模板扩增M基因片段,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组质粒pGEX-6p-1-M.测序正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,所获得的重组...     

非洲猪瘟病毒pO174L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了解析非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pO174L蛋白的功能,根据ASFV HLJ/18毒株基因序列(GenBank登录号:MK333180)设计引物,扩增O174L基因并克隆至pET-28a(+)载体中,构建原核表达载体pET-28a-O174L,并将其转化至大肠杆菌BL...     

A型塞内卡病毒VP3蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了研究A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA） VP3蛋白的功能,将SVA的VP3基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）构建重组质粒p ET32a-SVA-VP3,转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行诱导表达;用纯化复性后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western-blot与间接免疫荧光试验鉴定其特异性。结果表明,重组SVA VP3蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)以包涵体形式表达,分子质量约为44 ku;制备的家兔多克隆抗体能与SVA表达的VP3蛋白特异性结合,而不与口蹄疫病毒抗原反应,表明制备的SVA VP3蛋白家兔多抗血清具有良好的反应原性和特异性。重组SVA VP3蛋白及其多克隆抗体的成功制备为SVA血清学检测方法的建立、SVA致病机制及VP3蛋白功能的研究提供了材料支撑。     

NF-κB受体激活因子配体的表达及其多克隆抗体的制备

为获取猪源NF-k B受体激活因子配体(RANKL)及其抗体,根据GenBank中猪源RANKL的序列设计引物,将合成的RANKL基因克隆至pMAL-C4x表达载体,转化到大肠杆菌DH5α。经PCR和双酶切鉴定后测序分析,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21后通过IPTG诱导表达。优化表达条件,确定是包涵体表达,蛋白大小为78.1 ku。使用纯化的RANKL为抗原免疫兔制备多克隆抗体。构建重组质粒pCMV-RANKL,表达目的蛋白并使其与多克隆血清反应。经ELISA、Western-blot和IFA鉴定,证实抗RANKL多克隆抗体有良好的抗原特异性,为后续黏膜免疫的研究奠定了基础。     

牛结节性皮肤病病毒ORF006蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF006蛋白的生物学功能,制备了ORF006基因的多克隆抗体,用PCR技术获得LSDV ORF006的基因片段克隆至pET-28a原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,LSDV ORF006基因全长约696 bp;pET-28a-ORF006重组质粒在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约28.0 ku目的蛋白;ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶102 400;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别ORF006蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别LSDV感染MDBK细胞表达的ORF006蛋白。本研究为进一步探究LSDV ORF006蛋白生物学功能奠定了基础。     

水牛匈爱病毒结构蛋白VP1的截短表达及多克隆抗体的制备

为了制备水牛匈爱病毒（BufHuV）结构蛋白VP1截短基因的多克隆抗体,将病毒的VP1截短基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）获得重组质粒pET-32a-BufHuV-VP1,重组质粒转化至BL21感受态细胞（DE3）后诱导表达,VP1截短蛋白的分子质量约为31.5 ku,主要以包涵体的形式表达。以纯化好的重组蛋白免疫昆明小鼠以制备多克隆抗体,通过Western-blot与IFA鉴定其特异性。结果显示,制备的小鼠多克隆抗体能与纯化的VP1重组截短蛋白和感染BufHuV的细胞表达的VP1特异性结合,表明多克隆抗体具有良好的反应原性和特异性。水牛匈爱病毒VP1截短重组蛋白及其多克隆抗体的成功制备为研究BufHuV致病机制、VP1蛋白功能以及血清学检测方法的建立提供了材料基础。     

环形泰勒虫TaSDP基因的原核表达及TaSDP蛋白多克隆抗体的制备

利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增TaSDP(Theileria annulata schizont-derived protein)基因,用获得的基因片段构建原核表达载体pET-30a(+)-TaSDP,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,蛋白以包涵体的形式存在;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并分别用ELISA和Western-blot测定抗体的效价及特异性。结果显示,获得的TaSDP基因的长度为552bp,制备的多克隆抗体不仅可与重组蛋白His-TaSDP发生反应,而且可以识别天然的虫体蛋白,效价高于1∶215。上述研究结果为开展TaSDP在细胞调控方面的研究奠定了基础。     

猪白细胞介素21基因的原核表达与多抗血清的制备

为了制备猪白细胞介素21(porcine interleukin-21,pIL-21)的多克隆抗体,采用RT-PCR从猪外周血单个核细胞(PBMC)扩增获得pIL-21基因,然后将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a(+)之中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,pIL-21以可溶性蛋白形式表达,分子质量为35ku,具有良好的反应原性。经过Ni-NTA镍离子亲和层析纯化,获得纯化的重组蛋白pIL-21。用其免疫BALB/c小鼠制备抗pIL-21血清抗体。Western-blot分析结果显示,该抗体可与杆状病毒表达的重组Cap-pIL-21、ConA和PHA共刺激的猪PBMC细胞发生特异性反应,ELISA抗体效价可达1∶12 800。上述研究结果为pIL-21的生物学功能研究奠定了重要基础。