貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

猪流感病毒广东株的分离鉴定及其特性

对广东省 2 5个猪场有呼吸道症状的 30～ 6 0日龄仔猪 ,用棉拭子采样 ,接种鸡胚分离病毒。经鉴定 ,7株为H1N1亚型毒株。对其中 3株分离株的形态学、部分理化特性和生物学特性的研究结果表明 ,病毒粒子在透射电镜下为杆状、丝状、椭圆形及圆形 ,大小为 80～ 12 0nm ;血凝素(HA)均为热不稳定型 ;均不耐热且对乙醚、氯仿敏感 ;均能凝集公鸡、豚鼠、兔、大白鼠、山羊等动物红细胞 ,对小白鼠红细胞的凝集性有所不同 ,均不凝集牛和猪红细胞 ;经绒毛尿囊腔接种 9日龄鸡胚 ,不能导致鸡胚死亡 ,EID50 分别为 10 — 6 .17/ 0 .2mL、10 - 5.83/ 0 .2mL、10 - 4.4 3/ 0 .2mL ;经鼻腔途径感染小白鼠 ,均未导致小鼠出现症状和死亡 ,接种后第 14d在部分存活的小鼠血清中可检出病毒抗体。     

贵州省鸡减蛋综合征病毒分离株的生物学特性鉴定

从贵州省出现产蛋下降等症状的鸡群中分离出１株病毒，命名为ＨＳ１。该病毒对鸭胚致死率达５５６％～６６７％；在尿囊液中产生高效价的红细胞凝集素，第７代鸭胚尿囊液的血凝效价达到２１５～１８；在ＤＥＦ单层细胞上生长良好，并引起明显的细胞病变，感染细胞的核内观察到嗜碱性包涵体；将分离毒株回归蛋用鸡复制出与自然病例相类似的临床症状，全部感染鸡都产生ＥＤＳ血清抗体；病毒呈球形粒子，直径７０～８０ｎｍ，无囊膜，对氯仿、乙醚不敏感；能凝集鸡、鸭、鹅的红细胞，不凝集哺乳动物的红细胞；病毒核酸类型是ＤＮＡ，不分节段，分子含有３３６ｋｂ。在交叉血细胞凝集抑制试验中，分离毒株对红细胞的凝集特性能够被ＡＶ１２７超免疫血清所抑制，而不与新城疫阳性血清、正常健康鸡血清发生交叉反应；在病毒中和试验中，ＨＳ１与ＡＶ１２７毒株能够发生交叉中和反应，显示它们具有相同的抗原关系。根据对病毒分离株的致病性、血凝谱、理化特性和血清学关系的鉴定，证明从贵州分离的ＨＳ１与国际标准毒ＡＶ１２７属于同一血清型，是１株ＥＤＳ病毒。     

腺胃型IBV豫北株的分离鉴定及灭活疫苗的研制

1998年9月,豫北地区一些鸡场的鸡群发生了以腺胃肿胀为特征的传染病.采集腺胃组织进行病原分离,鸡胚传至8代以上时出现典型侏儒化和规律性死亡;鸡胚尿囊液经磷钨酸负染后电镜下观察,可以看到有囊膜和纤突,圆形,直径90-160 nm的病毒粒子;未经处理的分离毒株不能凝集鸡红细胞,经卵磷脂酶C处理后能凝集鸡红细胞,此凝集能特异的被抗分离株超免疫血清所抑制.用分离毒株制备油佐剂灭活疫苗,保护率达100%.建议预防IB时用本地区分离株制成多价灭活疫苗免疫,效果会更好.     

鸽Ⅰ型副粘病毒的分离和鉴定

用分离的对鸽有致病性的4株禽副粘病毒通过电镜观察、病毒中和试验和动物回归试验结果显示,病毒粒子呈球形,直径100～450 nm,表面有纤突;能凝集鸡红细胞,血凝反应能被新城疫病毒(NDV)和鸽Ⅰ型副粘病毒(PPMV-1)阳性血清所抑制;接种1月龄乳鸽能使其发病,出现明显症状和病变并有死亡,接种1月龄SPF鸡不发病;能在鸡胚成纤维细胞(CEFs)上生长,并能产生细胞病变(CPE);对高温敏感,在55℃放置60 min基本上无感染力;对乙醚、胰酶和酸(pH4.0)等敏感,二价镁离子对其有保护作用;各毒株均能产生蚀斑,蚀斑为浅灰色,形态较规则,清晰透明,直径2.0～4.5 mm.根据以上特性鉴定为PPMV-1,其中ZQ98-1及SZ98-1为中强毒力毒株,ZJ98-1及DG98-1为较弱毒力毒株.采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出ZQ98-1株F基因全长cDNA,经全自动测序,获得了ZQ98-1株F基因全序列,进一步从分子水平证明4株分离毒株为PPMV-1.     

鹅副粘病毒的分类地位初探

对从病鹅体分离的禽副粘病毒(GPV)YG97株,经红细胞凝集(HA)和红细胞凝集抑制(HI)试验证明,与新城疫病毒(NDV)存在着极大的相关性.参考NDV的3个毒力指标--最小致死量致病鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄非免疫雏鸡静脉接种致病指数(IVPI),对YG97株进行测定,表明其具有与NDV速发型类似的毒力,属强毒力的毒株.应用RT-PCR技术对F基因重要功能区片段扩增后进行序列测定,并与多株已报道的NDV相应片段进行序列比较,经遗传进化树分析后,初步判定其为禽副粘病毒-Ⅰ型,属基因Ⅶ型NDV.     

禽呼肠孤病毒鸡源分离株的鉴定与人工感染试验

从临床患病鸡关节病料中分离到一株病毒,在电镜下观察到病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,外衣壳直径约75 nm,内核约50 nm;分离病毒株对酸、热有较强的抵抗力,对乙醚不敏感;病毒感染鸡胚成纤维细胞上能产生以融合细胞为特征的CPE;爪垫接种1日龄雏鸡表现出明显的病毒性关节炎临床症状,并伴有吸收障碍型和坏死型的病理变化;血清中和交叉试验表明,该病毒分离株与国内的2株番鸭源呼肠孤病毒(YH和YB)分离株和国外S1133呈不同程度的交叉反应。通过对分离病毒株进行电镜观察、理化特性试验、病毒感染力测定、致病性试验、血清学试验,可以确定该分离病毒为禽呼肠孤病毒。     

鸡腺病毒血清4型Hexon蛋白的表达及与不同血清型抗体的交叉反应性评价

自2015年我国鸡群大面积暴发肝炎-心包积水综合征以来,我国鸡群鸡腺病毒流行呈现多血清型的复杂情况,甚至同一鸡群有多种血清型鸡腺病毒同时存在,其中鸡腺病毒血清4型(FAdV-4)对鸡的致病性最强。为了解FAdV-4衣壳蛋白Hexon蛋白与其他血清型鸡腺病毒抗体之间的交叉反应性,本研究将FAdV-4 HN/151025毒株的Hexon基因进行分段表达,表达蛋白分别位于CH1(1～370 aa)、CH2(371～671aa)和CH3(672～937 aa)片段。将FAdV-4 HN/151025毒株的Hexon基因的3段表达产物分别与FAdV-4、FAdV-1、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11型抗血清进行Western-blot反应。结果显示,FAdV-4 Hexon蛋白与不同血清型抗体之间均有交叉反应,但不同片段的交叉反应强度有所差异。FAdV-1型血清可与FAdV-4Hexon蛋白CH1和CH2片段发生反应,说明FAdV-4 Hexon蛋白的1～671 aa与FAdV-1型血清有交叉反应。FAdV-8a和FAdV-8b型血清仅与FAdV-4 Hexon蛋白CH2片段发生反应,说明FAdV-8a和FAdV-8b型血清与FAdV-4 Hexon蛋白的交叉反应区域在371～671 aa内。FAdV-11型血清可与FAdV-4 Hexon蛋白的3个片段发生反应,提示FAdV-11与FAdV-4型之间有交叉保护。血清4型FAdV的Hexon蛋白与不同血清型FAdV抗体间的交叉反应及其主要反应区域的研究,将对不同血清型FAdV疫苗的研制及不同血清型FAdV鉴别诊断提供依据。     

溶菌酶释放蛋白介导猪链球菌2型的血凝活性

比较了猪链球菌 2型 (SS2 )MRP+ 菌株HA980 1和MRP-菌株 0 0 64 44的血凝特性及溶菌酶释放蛋白 (MRP)在血凝过程中的作用。 2株菌均能凝集人A、B、O型及猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠、绵羊、山羊、水牛的红细胞 ,不凝集鸡、鲫鱼、鲤鱼、金鱼的红细胞 ,且对人、猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠红细胞的凝集价极显著高于绵羊、山羊和水牛 (P <0 .0 1) ;MRP+ 菌株对人、猪、兔、BALB/c小鼠和豚鼠红细胞的凝集价均极显著高于MRP-株 (P <0 .0 1)。MRP+ 株的血凝活性对热处理极其敏感 ,且凝集速度和反应温度呈负相关。半乳糖、胰酶预处理MRP+ 株菌体能完全阻断其血凝 ,葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、过氧化氢、巯基乙醇对其则无明显影响。用纯化的MRP处理红细胞、抗MRP兔血清和MRP的单克隆抗体处理菌体 ,均能显著降低MRP+ 菌株的凝集价 (P <0 .0 5 ) ,但不能完全抑制 ;用抗MRP-菌株兔血清处理菌体 ,也能显著降低MRP+ 株凝集价。试验证明 :MRP是SS2的黏附素 ,具有半乳糖特异性受体 ,且和其他毒力因子之间存在协同作用     

云豹病毒性肠炎的研究——病性鉴定

通过对云豹病例的病性鉴定,证明在杭州动物园金猫、华南虎、东北虎、云豹、狮子和小灵猫中发生的以下痢、呕吐、血液白细胞显著减少、发病急、病程短为特征的疾病是病毒性肠炎。并自云豹的病理组织中检查到包涵体及用病料匀浆负染电镜观察到病毒粒子,其大小为24～28nm,蔗糖浮密度为1.28～1.34g/cm~3。这种病毒粒子,我们称为云豹细小病毒(LPV)。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离及其N基因片段的克隆和测序

通过形态学观察、动物回归试验、鸡胚接种试验、病毒干扰试验以及血凝试验分离鉴定了1株肾型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。在透射电子显微镜下,病毒粒子多呈球形,直径为80~120 nm,有囊膜,表面有冠状突起。鸡胚连续盲传至第 1~2 代,开始出现死亡或出现侏儒胚;分离株可显著干扰NDV在鸡胚中的增殖;病毒尿囊液无凝血活性,但经5 g/L胰蛋白酶处理后,能够凝集10 mL/L的鸡红细胞。利用RT PCR技术对分离株的N基因进行了扩增,经克隆、序列测定和分析比较,证实分离株为肾型IBV,命名为AH3 04株。     

鸭2型腺病毒的分离鉴定及hexon基因的序列分析

为了鉴定广东惠州某鸭场疑似鸭肝病患病鸭的病原,通过接种11日龄番鸭胚,从发病鸭群病料中分离出1株未知病毒,经PCR鉴定为鸭2型腺病毒。选取第6代毒株进行血凝性、鸭胚致病性、致细胞病变、动物回归试验以及六邻体(hexon)基因序列分析。结果表明:接种病毒后第36~72小时,鸭胚集中出现死亡,胚体全身弥漫性出血,ELD_(50)为1×10~(6.31)/m L;分离的病毒不凝集鸡、鸭红细胞,在鸭胚成纤维细胞上可致细胞变圆、折光性增强等病变。将0.1 m L病毒液经肌肉接种1日龄泥鸭,主要引起雏鸭肝、脾出血和肿大。分离株hexon基因与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株(登录号:KR135164.1)和GR株(登录号:NC_024486.1)的核苷酸同源性分别为100%和76.6%。本试验为深入研究鸭2型腺病毒的致病机制及综合防控提供了重要的基础数据。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒JH9801株的分离鉴定

从天津市某肉用鸡场疑似肾型传染性支气管炎(NIB)病鸡中取肾组织,按常规处理后接种9-10日龄鸡胚,连续传代培养至第7代,并对4-7代分离毒株的致病性、血凝性、EID50及对DNV的干扰性和乙醚敏感性进行测试,同时进行了动物回归试验.结果表明,4-7代分离毒株可使85%-90%鸡胚于接种后8-9 d死亡,多数死胚和残存活胚胚体出血、蜷缩、矮化等具有IBV感染特征;该分离毒株无直接血凝性,但经10 g/L胰酶处理后可凝集鸡红细胞;分离毒株对乙醚敏感;动物回归试验中有65%的感染鸡在15 d内发病或死亡.剖检病死鸡可见肾苍白、肿胀,肾小管内充塞大量尿酸盐,外观呈菜花样.经鉴定,分离的病毒株JH9801为鸡肾型传染性支气管炎病毒(NIBV).     

东北地区新城疫流行株的分子生物学特性调查

从东北地区发生新城疫 (ND)的病鸡、病鸽和产蛋下降鸡分离到 19株NDV ,对其融合蛋白 (F)基因 5 32bp或 2 80bp片段进行了克隆、测序 (在GenBank中的登录号为AY2 0 86 80～AY2 0 86 98) ,并对各株的F基因序列进行了比较。结果 ,各毒株之间的核苷酸同源性为 83.1%～10 0 % ,氨基酸同源性为 85 .5 %～ 10 0 % ;系统发育进化树分析表明 ,其中 2株与疫苗株V4同属基因Ⅰ型 ,为弱毒株 ;其余 17株为强毒株 ,其中 2株为基因Ⅵ型 ,其余为基因Ⅶ型。表明东北地区目前由 3种基因型的NDV毒株 (Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型 )所引发 ,并以基因Ⅶ型为主。另外 ,对其中的代表毒株APMV1/chicken/China/JL 11/ 0 2进行了免疫学试验 ,结果显示 ,LaSota疫苗的免疫保护效果不理想 ,可能是LaSota疫苗免疫鸡群发生ND的主要原因。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒四川株的分离鉴定及Nsp2生物信息学分析

为了解四川省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况及分子特征,本研究选用2012—2014年四川省不同地区采集并诊断为PRRSV阳性的病料,以Marc 145细胞进行病毒分离,经蚀斑纯化,病毒基因扩增、测序后与NCBI现有序列进行比对分析并通过构建系统进化树等方法研究分离株的分子特征。共成功分离到10株PRRSV,分析证明所有分离毒株均是高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)株,序列比对显示,其中SC2012、SC2012-2株Nsp2部分基因与众多HP-PRRSV株核苷酸同源性在91%~97%之间,与经典毒株CH-1a株同源性为72.9%,与所有BLAST毒株相比存在新缺失位点,与CH-1a、BJ-4株相比,在Nsp2蛋白485 aa~498 aa处存在14个连续氨基酸缺失,其他8株均含30个不连续氨基酸缺失。氨基酸同源性比对显示,SC2012、SC2012-2株高变区与国内分离株同源性介于61.5%~97.2%之间。通过TCID50法测得SC2012、SCSN2012-1、SCSN2012-2、SCCD2012、SCLS2012、SCMY2012、SCBZ2012、SCXC2012、SCXJ2012和SC2012-2病毒毒价分别为10~(-5.41)/m L、10~(-6.5)/m L、10~(-7.29)/m L、10~(-6.41)/m L、10~(-5.5)/m L、10~(-7.67)/m L、10~(-6.29)/m L、10~(-6.8)/m L、10~(-7.41)/m L和10~(-6)/m L。以上结果表明,本研究所分离的SC2012、SC2012-2株是新变异毒株,为四川省PRRSV分子流行病学和遗传变异研究奠定了一定基础。     

2007-2011年广东省猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析

为了解广东省2007-2011年猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株的遗传变异情况,采用PCR方法对本实验室分离到的49株PCV2分离株进行全基因组克隆和序列分析。所分离的毒株全长分别为2株1 766bp、45株1 767bp、2株1 768bp。通过序列比对进行遗传变异分析,无论是这49株病毒间还是与GenBank中的8株PCV2基因组间的核苷酸同源性均为93.2%～99.9%;在遗传演化关系上,49株分离株分布于2个大群,分别为PCV2b和PCV2d分支。提示目前疫苗毒株不处于广东地区PCV2流行毒株分支中,应该引起高度的重视。     

藏獒源犬细小病毒的分离鉴定

为弄清犬细小病毒(CPV)在藏獒中的流行情况,将临床上经胶体金试纸检测为阳性的藏獒直肠棉拭子8份处理后接种猫肾传代细胞(F81细胞),分离到6株病毒,对其进行了血凝试验(HA)、半数组织培养物感染剂量(TCID50)的测定,理化性质鉴定,提取分离株DNA并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其一特异性片段和VP2全序列,并与GenBank上登录的CPV毒株进行比对。结果表明,接毒后第6～13天在F81细胞上出现了明显的细胞病变(CPE),表现为细胞融合、变圆或拉长;所得分离株能使猪红细胞发生凝集反应,血凝效价为27～211;能抗酸(pH3)、热(60℃)、200mL/L乙醚、480mL/L氯仿;从细胞培养物中分别扩增出与特异性片段825bp一致以及与VP2全基因1 755bp一致的条带。将扩增的VP2序列与GenBank上登录的HQ883267.1、FJ222823.1、FJ005214.1等10个国内外CPV分离株的VP2序列进行比对;结果显示,与北京地区一分离株(HQ883267.1)的同源性最高,为99.0%～99.6%。所得分离株为不同毒株,但均为CPV-2a型。     

玉米赤霉烯酮免疫检测技术研究——分泌抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用F-2-BSA人工抗原免疫Balb/c鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,建立6株分泌抗F-2毒素的McAb杂交瘤细胞株。用间接ELISA法测定,细胞上清液抗体滴度为2084~×(4H_8)、256~×(6H_9、4H_3、2H_5、2C_8)、16~×(3F_(10));腹水抗体滴度为10~(-9)(4H_3、4H_8),10~(-8)(2H_5)、10~(-7)(6H_9)、10~(-6)(2C_8)、10~(-5)(3F_(10))。用竞争间接ELISA法测定6株McAb对F-2毒素的敏感度为0.8～0.3ng/ml。该抗体与同系物(玉米赤霉烯醇)交叉反应率为9.0％～1.3％。6株McAb均属IgG类。细胞体外传代培养和冻存复苏后,分泌抗体稳定。纯化抗体在37℃保存12天稳定。     

牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

采集内蒙古地区疑似发生牛传染性鼻气管炎的发病牛的鼻拭子液,经MDBK细胞连续传代培养,分离获得1株病毒,该病毒在MDBK细胞上增殖致细胞病变。经PCR鉴定、间接免疫荧光试验和动物回归试验,证明该分离株为牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),对牛具有较强的致病性,将其命名为IBRV NM8株。通过PCR扩增分别获得gB和gE全基因序列,遗传进化分析表明,IBRV NM8株g B和g E基因与BHV-1型参考毒株的同源性较高,位于同一进化分支,而与BHV-5型参考毒株位于不同的进化分支。NM8株gB基因与Cooper株、MN12株、Los Angeles株和NM06株等的亲缘关系相对较近,而g E基因与瑞典的Salwa株的亲缘关系较近,位于同一分支。上述研究结果将为我国IBRV流行病学研究提供新的数据,并为相关后续研究奠定基础。     

A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因的克隆表达及其产物的生物学活性鉴定

根据GenBank中登录的A型Hpg Hp8株血凝素基因序列,设计合成了1对特异性引物,以Hpg Hp8株中提取的细菌DNA为模板,利用PCR扩增了Hpg血凝素全长基因(1 035 bp),将其克隆到pET-32a( )载体上,构建了原核表达载体pET-HA,表达并纯化了重组蛋白,通过免疫印迹及血凝和血凝抑制试验鉴定了该重组蛋白的生物学活性。结果显示,表达并纯化的HpgHA重组血凝素蛋白可以和A型Hpg抗血清特异性结合,并且可以凝集鸡红细胞。表明,成功地构建了Hpg血凝素基因的原核表达载体,并表达、纯化了具有凝集鸡红细胞活性的Hpg-HA融合蛋白。