鸭瘟病毒UL24基因的分子特征分析

根据本实验室获得的鸭瘟病毒的一段基因序列设计引物,利用PCR扩增UL24基因并克隆到pMD18-T载体,阳性重组质粒进行酶切鉴定、测序验证与生物信息学分析.结果显示,获得的UL24基因全长1 230 bp,编码409个氨基酸;与其他26株疱疹病毒科中α-疱疹病毒亚科的UL24基因的相似性较β和γ亚科高,其中与α亚科禽疱疹病毒属中的GaHV-3相似性最大(34.7%);遗传进化树显示,该基因编码的蛋白与火鸡疱疹病毒的UL24蛋白的亲缘性最近.该蛋白是一种保守但不舍信号肽的外膜蛋白,具有5个潜在的N-糖基化位点和19个磷酸化位点;编码的氨基酸Ala,Apn,Glu,Phe,Leu,Arg,Thr,Val具有一定的偏嗜性.二级结构分析显示,α螺旋和无规卷曲含量高,均达46.94%,而β折叠仅占6.11%;同源建模比对,未发现与之匹配的三级结构;预测的抗原表位主要位于肽链第36～48、241～323、344～379位区段.     

狂犬病病毒aG株G基因的克隆与生物信息学分析

为了研究狂犬病病毒aG株的进化情况,分析狂犬病病毒的遗传变异和基因功能,采用BHK-21细胞培养繁殖狂犬病病毒aG株,运用RT-PCR扩增G基因,将其与pMD18-T simple vector连接后转化JM109感受态细胞,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,狂犬病病毒G蛋白基因全长1 575bp,包含1个阅读框(ORF),编码524个氨基酸。生物信息学分析表明,G蛋白的分子质量为58 377.22u,理论等电点为7.080,半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞),不稳定系数为42.99,脂肪指数为88.45,总平均亲水性为-0.106,最大疏水性为3.489,最小疏水性为-2.600,信号肽序列为1～19位氨基酸残基,跨膜区结构分析显示该蛋白为跨膜蛋白,预测可能包含有4个N-糖基化作用位点,2处基于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点,13处蛋白激酶C磷酸化位点,12处酪蛋白Ⅱ磷酸化位点;1处酪氨酸激酶磷酸化位点;9处N豆蒄酰化位点;1个酰胺化位点。系统进化分析表明,aG株G蛋白与DRV株进化距离最近。     

大熊猫轮状病毒CH-1株VP1基因的克隆和生物信息学分析

为研究大熊猫源轮状病毒(RV)CH-1株外衣壳蛋白VP1基因的结构及功能,采用MA-104细胞增殖大熊猫源RV,提取总RNA,运用RT-PCR扩增VP1基因,将阳性克隆进行测序,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得了长3 287bp的GPRV VP1蛋白基因(GenBank登录号:HQ641297);经生物信息学分析,此序列包含有一个3 267bp的完整开放阅读框,编码1 089个氨基酸;无信号肽;无跨膜区,其整个蛋白都位于病毒膜外区;抗原表位预测显示VP1蛋白有41个抗原表位;系统进化树分析显示大熊猫轮状病毒CH-1株VP1基因与猪A组轮状病毒VP1基因的进化距离最近。本研究成功获得了大熊猫源RV VP1基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。     

鸭瘟病毒gC基因的克隆及其分子特性分析

对已构建的鸭瘟病毒(DPV)DNA文库重组质粒测序后,运用ORF Finder、BLASTN等工具进行全面生物信息学分析,根据分析结果设计引物,以DPV DNA为模板进行PCR扩增和T克隆,获得完整基因,经测序和探针核酸斑点杂交进行验证。结果证实,获得的完整ORF片段(ORF1296)为DPV的gC基因(GenBank登录号EU076811),全长1 296 bp,与已报道的其他疱疹病毒gC基因具有较高的同源性,它编码432个氨基酸,蛋白分子质量为45 ku、等电点(PI)为5.292,具有疱疹病毒典型I型膜蛋白结构特征。gC基因进化树分析表明,DPV与α-疱疹病毒亚科的鸟源疱疹病毒亲缘关系最近,编码的gC蛋白多为柔性区域,富含无规卷曲,含少量α-螺旋和β-折叠,氨基酸序列的第21～24、50～58、67～70、161～171、273～281、387～393位最有可能为抗原表位。此结果为进一步开展DPV gC基因及其编码蛋白的深入研究提供了有用数据。     

大熊猫轮状病毒CH-1株NSP4基因的克隆与生物信息学分析

用MA-104细胞增殖大熊猫轮状病毒(RV),并提取总RNA,经RT-PCR扩增,获得NSP4基因,将其克隆到载体进行测序,应用生物信息学方法初步分析NSP4基因的结构及功能,并与不同动物的RV构建系统进化树。结果显示,获得了长750bp的大熊猫RVNSP4基因,此序列包含1个528bp的完整开放阅读框,编码175个氨基酸;预测大熊猫RVNSP4基因的理论分子质量为20223.7u,等电点为6.84,半衰期为30h,不稳定系数为30.40,总平均亲水性为-0.240,疏水性为-2.400～2.622;无信号肽序列;跨膜结构分析表明,NSP4有1个跨膜区,其N端位于病毒膜外区,C端位于病毒膜内区;抗原表位预测显示,NSP4有6个抗原决定簇;结构预测显示,其可能包含2个N-糖基化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化作用位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点和1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点;系统进化树分析显示,大熊猫RV NSP4基因与猪RV NSP4基因的进化距离最近。     

大熊猫轮状病毒CH-1株外衣壳蛋白VP4基因的克隆与生物信息学分析

利用MA-104细胞培养增殖大熊猫轮状病毒CH-1株,提取总RNA,运用RT-PCR扩增外衣壳蛋白VP4基因,将其与pMD19-T simple vector连接并转化DH5α,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,成功获得大熊猫轮状病毒VP4蛋白基因,长2 362bp,包含一个2 331bp的开放阅读框,编码776个氨基酸,测序结果在GenBank中的登录号为HQ641296。生物信息学分析表明,VP4蛋白基因编码产物分子质量为86 768.8u,理论等电点为5.56,半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞),不稳定系数为28.64,脂肪指数为82.53,总平均亲水性为-0.265,最大疏水性为2.244,最小疏水性为-2.911;无信号肽序列;跨膜结构分析显示VP4蛋白无跨膜区,位于病毒膜外区;在VP4序列中的抗原决定簇主要位于VP4的N-末端和C-末端。预测其可能包含8个N-糖基化作用位点,15个蛋白激酶C磷酸化作用位点、15个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、12个N-豆蔻酰化位点。系统进化分析显示,大熊猫轮状病毒的VP4基因与猪轮状病毒的VP4基因的进化距离最...     

环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白基因侧翼序列的hiTAIL-PCR扩增及其生物信息学分析

为扩增环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白基因的侧翼序列,从感染环形泰勒虫的淋巴细胞系中提取RNA,反转录合成第1链cDNA。以该cDNA为模板,利用高效热不对称交互PCR法(hiTAIL-PCR)进行扩增,将目的片段连接到pGEM-T Easy载体并进行测序。结果显示,获得了环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白基因的5′端侧翼序列,该序列编码894个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该蛋白具有信号肽,信号肽剪切部位位于第19~20个氨基酸残基之间,很可能是一种分泌蛋白;经TMHMM2.0预测,该蛋白在第875~892位氨基酸残基部位具有典型的跨膜结构;Motifscan预测的结果显示,环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白存在2处N-糖基化位点(153NLSF、333NESM)和15处CK2蛋白激酶磷酸化位点;在该蛋白第500~650位氨基酸残基部分具有较高的抗原性,推测可能是该蛋白与其他蛋白发生相互作用的区域。     

番鸭呼肠孤病毒YB株μB蛋白的原核表达与生物信息学分析

为研究番鸭呼肠孤病毒YB株(MDRV-YB株)μB蛋白基因与其他多株参考毒株之间的遗传进化关系以及对该序列的结构功能预测和进行蛋白的原核表达,本试验通过RT-PCR方法从MDRV中特异性扩增μB基因,并构建重组质粒pET-YB-μB,经测序获得其完整的CDS区;通过DNAstar等软件对MDRVYB株μB基因进行生物学信息分析,预测其编码蛋白的结构功能;重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达μB融合蛋白。结果显示,μB蛋白基因CDS区全长2031 bp,共编码676个氨基酸;μB蛋白分子式为C3217H5105N879O1014S27,不存在信号肽,可能含有4个N-糖基化位点、85个磷酸化位点,二级结构中α螺旋结构、β螺旋结构、β转角结构和无规卷曲的氨基酸残基分别占27.6%,53.3%,10%和9.1%;在核苷酸同源性方面MDRV-YB株μB基因与番鸭呼肠孤病毒ZJ2000M株同源性高达99.8%,与其他多株鸡源呼肠孤病毒、鸭源呼肠孤病毒和鹅源呼肠孤病毒同源性都很低,仅为67.3%~69.6%;进化树分析结果显示,MDRV-YB株与MW9710株处于最近的分支;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,经IPTG诱导,重组质粒pET-YB-μB成功表达了大小约为99.1 ku的μB融合蛋白,并且该蛋白反应原性良好。本试验结果为MDRV的遗传进化和μB蛋白功能的研究奠定了基础,为进一步研究MDRV的致病机制提供了数据支撑。     

鼠伤寒沙门菌SL1344 sseK2基因的克隆表达及生物信息学分析

为研究鼠伤寒沙门菌SL1344株SseK2蛋白的生物学特性,通过PCR扩增sseK2基因,构建原核表达质粒pET-32a-sseK2,经大肠杆菌BL21(DE3)表达、纯化后经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,对sseK2基因编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,鼠伤寒沙门菌SseK2蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,纯化获得较高纯度的蛋白。生物信息学分析显示,SseK2蛋白为可溶性蛋白,由348个氨基酸组成,分子质量约39.57 ku。该蛋白不含信号肽、无跨膜区,为膜外蛋白,包含4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、56个磷酸化位点、15个B细胞线性结合位点和8个T细胞结合位点以及10个二硫键。其蛋白二级结构中以α-螺旋(Hh)占33.05%,无规则卷曲(Cc)占27.30%为主。成功构建了原核表达载体,并对其进行生物信息学分析,为进一步研究sseK2基因的生物学功能及在沙门菌致病机制中的作用奠定了良好基础。     

猪流行性腹泻病毒青海株M蛋白基因的克隆与功能位点分析

克隆了猪流行性腹泻病毒(PEDV)青海株(PEDV-QH)的M基因。经序列分析,PEDV-QH株编码膜蛋白M的开放阅读框(ORF)全长为681 bp,包含154A(22.61%),160G23.49%),217T(31.86%),150C(22.03%),编码226 aa,分子质量约为25 ku。PEDV-QH株的M基因与CV777、JMe2、Br1/87、JS-2004-2、KPEDV-9株核苷酸序列的同源性分别为98.5%、98.4%、98.4%9、8.2%和97.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为99.1%、99.1%、98.7%、98.2%、97.8%;M基因推导的氨基酸序列分析显示,M蛋白3次跨膜,有1个潜在的原核膜脂蛋白脂结合位点,3个潜在的N-糖基化位点,4个潜在的丝氨酸或苏氨酸连接的蛋白激酶C或酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。与CV777及Br1/87核苷酸序列以及氨基酸遗传衍化关系分析显示,PEDV-QH株M基因的变异主要属于同义突变。     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。     

猪圆环病毒2型ORF2与EGFP融合蛋白表达载体的构建及在鸭心肌细胞中的表达

为研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在异源细胞上的表达及生物学特性,构建了PCV2ORF2与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP-N1-ORF2。采用脂质体法转染体外培养的鸭心肌细胞后,通过直接荧光观察EGFP-ORF2融合蛋白在鸭心肌细胞中的分布定位,经RT-PCR、间接免疫荧光方法检测ORF2基因在鸭心肌细胞中的表达。结果显示,转染48 h后有绿色荧光出现,RT-PCR和间接免疫荧光法检测均为阳性。证实,PCV2 ORF2基因在鸭心肌细胞内获得了成功表达。     

猪生殖与呼吸综合征ORF5基因疫苗的构建及其安全性和免疫原性检测

克隆了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SC2株ORF5基因。测序分析表明SC2株属美洲型PRRSV。构建的ORF5基因疫苗经脂质体转染Marc 145细胞后,第26h检测到疫苗蛋白的特异性表达,第56h达到高峰。疫苗肌肉注射小鼠和仔猪后能迅速分布到各组织器官中,未发现核酸疫苗与宿主细胞染色体整合现象;且能使仔猪产生体液和细胞免疫应答,免疫期持续135d以上。结果表明,构建的PRRSVORF5基因疫苗具有良好的安全性和免疫原性。     

堆型艾美球虫表面抗原基因cSZ1在大肠埃希氏菌中的表达

根据已克隆的堆型艾美球虫 (Eimeriaacervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物 ,用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架 (ORF)后克隆至表达载体pET 32a( ) ,构建了重组表达质粒 pET 32a( ) cSZ1,并将其转化至大肠埃希氏菌BL2 1(DE3)。经IPTG诱导 ,获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达 ,表达产物量可达菌体总蛋白的 9.3% ,融合蛋白的分子质量约为 4 0ku。重组菌诱导表达的产物经SDS PAGE后 ,用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析 ,结果为阴性 ,提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位     

猪链球菌2型mrp基因ORF1序列的克隆及原核表达

根据猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因(mrp)的序列,设计并合成了1对特异性引物,以青海株的基因组DNA为模板扩增了mrp基因ORF1序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a( )中,构建了原核表达质粒pET-28a-mrp,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(27.0 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。研究结果为今后开展该病的免疫学研究奠定了一定基础。     

猪圆环病毒Ⅰ型ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)ORF1基因序列,设计合成了1对引物,对PCV1 ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(939 bp)克隆入pMD18-T载体,将筛选获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。测序分析表明,克隆的ORF1与广东分离株DQ659154的核苷酸序列同源性高达99.6%,推导的氨基酸序列同源性为99.4%。将ORF1双酶切产物插入原核表达载体pET-41a,得到的重组子命名为pET-ORF1。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,PCV1ORF1在pET-41a中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为67.6 ku。     

鹅副粘病毒HN基因的克隆与序列分析

以鹅副粘病毒GPVSF0 2毒株的基因组RNA为模板 ,通过RTPCR方法扩增出HN基因片段 ,然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序 ;测序后拼接得出HN基因的全序列。经分析HN基因编码区核苷酸序列 ,所测GPVSF0 2毒株与参考毒株NL 96核苷酸序列的同源性为 86 %。     

鸡白细胞介素-17基因的克隆和序列分析

根据GenBank中收录的鸡白细胞介素-17(ChIL-17)基因的cDNA序列设计了1对特异性引物,以经ConA刺激3h的鸡脾淋巴细胞总RNA为模板,用RT-PCR方法成功克隆了ChIL-17的cDNA。该cDNA全长725bp,其中第2~508位是该基因的阅读框(ORF),共编码169个氨基酸。与已报道的序列相比较,二者核苷酸序列的同源性为99.6%(722/725),共有3个碱基发生变异,其中有2个变异位于阅读框之内。DNAssit软件分析表明,二者推导的氨基酸序列同源性为100%。同时,以鸡脾淋巴细胞DNA为模板,用PCR方法首次扩增获得了ChIL-17的基因组DNA序列,经序列分析,其序列全长1934bp,由2个内含子和3个外显子组成,3个外显子分别位于第2~27、569~815和1484~1720bp处。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株TA4基因的克隆和原核表达

根据国外报道的序列设计1对引物,以纯化的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌(YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的TA4基因.序列分析表明,该序列全长741 bp,开放阅读框(ORF)为651 bp,共编码217个氨基酸,与E.tenella HT株、E.tenella BJ株和E.tenella ZJ株的TA4基因ORF序列同源性分别为99.8%、99.8%和99.27%.由此确定所获得的目的基因为E.tenella YL株TA4基因.利用生物信息学和分子生物学软件对TA4基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为一结构松散的球状蛋白.将TA4基因克隆到表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-TA4并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物的SDS-PAGE分析结果表明,成功地表达了分子质量为41 ku的融合蛋白.