绵羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析条件的优化

为进行绵羊PRNP等位基因密码子136、154、171的多态性研究,建立适合于绵羊PRNP等位基因开放阅读框(ORF)内高变区PCR-SSCP分析方法,对凝胶浓度、交联度、甘油浓度、电泳电压、电泳时间、PCR产物与变性缓冲液比例、电泳缓冲液浓度、上样量等影响因素进行了优化试验.在优化中引入了正交试验法,以使优化过程简化,结果可靠.结果表明,交联度49:1、甘油浓度0%、凝胶浓度12%、电泳电压200 V、PCR产物上样量≥2.0μL且<4.0μL、PCR产物与变性缓冲液比例1:4、0.5×TBE缓冲液及4℃电泳45 h为最佳试验条件,据此建立了绵羊PRNP等位基因136、154、171密码子的PCR-SSCP分析方法.     

堆型艾美球虫广东株3-1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的堆型艾美球虫31E基因序列,设计了3条引物,以广东株堆型艾美球虫裂殖子总RNA为模板,利用反转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增获得了31E基因部分片段,将这一片段克隆至pGEMTEasy载体中,经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较,证实了克隆片段的可靠性。序列比较发现,所克隆的基因片段与Eimeriaacervulina美国株(US)、E.acervulinaQH株31EcDNA的核苷酸同源性分别为99.0%和99.2%,推导氨基酸的同源性分别为98.2%和97.6%。     

片形吸虫第一内转录间隔区DNA多态性的研究

以不同地区的片形吸虫虫株为研究对象 ,经PCR扩增出了ITS 1部分基因片段 ,采用单链构象多态性 (SSCP)方法 ,并结合序列分析研究了不同地区片形吸虫ITS 1DNA的多态性。不同地区的样品经SSCP分析 ,显示 3种带型 ,第 1种为大片形吸虫的带型 ,第 2种为肝片形吸虫的带型 ,第 3种为 2种带形的混合带型。广西区样品和大部分贵州省样品属于大片形吸虫带型 ;四川省、黑龙江省和部分贵州省样品为混合带型 ;南京市和甘肃省样品为肝片形吸虫带型或混合带型。测序结果表明 ,根据ITS 1基因的序列变异位点可区分 2种片形吸虫 ;表现为混合带型的样品在变异位点具有多态性。本研究结果显示 ,ITS 1片段可作为遗传标记用以区分大片形吸虫和肝片形吸虫 ,同时也证实 ,在我国除了这 2种片形吸虫外 ,还可能存在着“中间型”的片形吸虫     

牦牛IFN-γ基因的表达及其产物的生物学活性分析

用植物血凝素和脂多糖诱导牦牛外周血淋巴细胞,提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术克隆了牦牛IFN-γ(YakIFN-γ)基因,然后设计了1对表达引物,从pGEM-YakIFN-γ载体上扩增YakIFN-γ成熟蛋白基因,将牦牛IFN-γ基因与表达载体pET-30a连接,构建了重组表达质粒pET-30-YakIFN-γ。用IPTG诱导表达的可溶性表达产物经镍柱亲和纯化,用纯化的重组YakIFN-γ蛋白进行了MTT、抑制肿瘤细胞增殖和细胞病变抑制的生物学特性研究。结果显示,成功克隆和表达了YakIFN-γ基因;序列分析表明:克隆的YakIFN-γ基因序列与GenBank上登录的黄牛IFN-γ基因序列的同源性为99.0%。SDS-PAGE分析和Western-blot检测证实,获得了高纯度的重组YakIFN-γ蛋白。重组YakIFN-γ(rYakIFN-γ)对伪狂犬病病毒的活性单位为2.2×103U/mg。表明表达并纯化的rYakIFN-γ蛋白具有较高的生物学活性和干扰病毒复制的活性。     

大通牦牛LF基因的克隆与分子特征

通过RT-PCR克隆了牦牛包含LF基因编码区的cDNA序列(GenBank登录号为EU547251);将克隆获得的LF基因的cDNA与乳牛相应序列进行了比对;对牦牛LF蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号为ACB29794)与其他物种的相应序列进行了比较,应用在线生物软件对牦牛LF蛋白的特性和结构进行了预测.结果表明,克隆获得的牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124bp,编码708个氨基酸;克隆获得的牦牛cDNA序列与乳牛该序列存在15个碱基的变异;各物种LF蛋白具有较高的同源性,LF蛋白进化树符合物种进化规律;牦牛LF蛋白含有α-螺旋36.0%、β-折叠22.4%、β-转角31.1%、无规卷曲12.9%;同源建模预测的LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成的2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由一段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈"二枚银杏叶型"结构.     

牦牛hepcidin基因编码区的克隆和原核表达

采用RT-PCR从牦牛肝中扩增到了hepcidin基因,将其克隆至pGEM-T载体,转化DH5α感受态细胞,获得了阳性重组质粒,牦牛hepcidin基因编码区长289 bp,编码82个氨基酸(GenBank:EU863791);与黄牛相比,牦牛hepcidin基因编码区序列存在1个碱基的变异,但未引起氨基酸的改变;将牦牛hepcidin基因编码区连接至pGEX-4T-1表达载体,成功构建了原核表达栽体pGEX-4T-hepcidin;IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示,35 ku处有特异性蛋白条带,表明牦牛hepcidin抗菌肽基因成功实现了原核表达.     

SPAG11基因在雄性牦牛生殖器官中表达的检测

为了检测精子相关抗原11(sperm-associated antigen 11,SPAG11)基因在雄性牦牛生殖器官中的表达谱并分析其组织表达特性,从牦牛附睾头总RNA中RT-PCR扩增SPAG11基因(SPAG11C、D、E、U、V和W),半定量RT-PCR分析SPAG11mRNA在牦牛生殖器官中的表达水平。采用合成的SPAG11E多肽制备牦牛SPAG11E多克隆抗体,免疫组织化学检测SPAG11E蛋白在睾丸和附睾中的表达及定位情况。结果显示,SPAG11C、U、V和W基因在睾丸和附睾相对低表达,而SPAG11D和E基因相对高表达;SPAG11C和U基因在输精管相对低表达,而SPAG11E相对高表达;除SPAG11D在卵巢相对低表达外,SPAG11基因在其他雌性生殖器官均不表达。免疫组织化学结果显示,SPAG11E蛋白在睾丸的精子细胞和附睾内壁精子头部表达。结果表明,SPAG11基因的表达具有组织特异性,提示它在牦牛睾丸和附睾中可能发挥重要的免疫功能和生殖功能。     

乳牛肝MTP基因mRNA定量检测模板的构建

应用RT-PCR方法,克隆394 bp的MTP片段,连接到pMD 18-T载体上构建pMD-MTP394重组质粒;应用限制性内切酶ApaⅠ消化重组质粒pMD-MTP394,切下一194 bp的小片段,回收大的线性片段,T4 DNA连接酶连接,成功构建了一个重组的竞争模板质粒pMD-MTP200,为建立竞争性RT-PCR法检测乳牛肝MTP基因mRNA奠定了基础。     

牦牛β-干扰素基因的克隆与表达

提取经植物血凝素(PHA)诱导培养的牦牛外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增并克隆了牦牛IFN-β基因,经PCR和酶切鉴定及测序分析,再克隆到pGEX-4T-1质粒载体中,构建了原核表达重组载体,经IPTG诱导表达重组蛋白,可表达约41 ku的牦牛IFN-β融合蛋白,主要以包涵体形式存在。序列分析结果表明,牦牛IFN-β基因ORF为498 bp,与乳牛IFN-β参考序列的同源性高达98.6%,与猪、马、猫、人IFN-β基因的同源性分别为72.5%、68.9%、66.1%和63.5%,而与狗、鼠、鸡等动物的同源性均不超过25%;分子遗传进化树分析也表明,牦牛与乳牛IFN-β基因的亲缘关系最近,而与鼠、狗、鸡等的亲缘关系较远,说明IFN-β基因有种属差异性。     

牦牛舌抗菌肽基因cDNA的克隆及其在生殖系统中的表达

为了解牦牛舌抗菌肽(LAP)基因序列的特征及其在生殖系统中的表达情况,采用RT-PCR法从牦牛睾丸、附睾组织中扩增LAP基因,重组到pMD19-TSimple载体中,进行了测序和序列分析,并应用RT-PCR检测了雌性牦牛生殖系统(卵巢、输卵管、子宫、阴道等组织)中LAPmRNA的表达。结果显示,克隆的LAP基因包含一195bp的完整开放阅读框(ORF),与牛LAP基因相似性达97.9%,该ORF编码的64个氨基酸含有β-防御素特征性结构,即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基;LAP在牦牛生殖系统上皮组织中均有表达。推测LAP在牦牛生殖系统的先天免疫中具有重要作用。     

妊娠期牦牛子宫肉阜上皮细胞的培养

为建立一种稳定、简便地获得较高纯度的牦牛子宫肉阜上皮细胞的方法,分别采用组织块种植法和联合消化法对妊娠8～10周龄牦牛的子宫肉阜上皮细胞进行原代培养及分离纯化,测试其培养的最适FBS浓度及pH值,并观察其大体形态等。结果显示,胎盘组织样品在37℃下,采用胰蛋白酶和胶原酶1∶1联合消化排除法分离子宫肉阜上皮细胞的效果好。pH6.8～7.0、含150mL/L FBS的DMEM/F12培养基适宜牦牛子宫肉阜上皮细胞的原代培养,pH6.8～7.0、含100mL/L FBS的DMEM/F12培养基较适宜传代培养。传代5次后经透视显微镜观察发现,细胞为上皮样形态,呈片状铺石路样生长。表明,用联合消化排除法可简单、有效地获得较高纯度的牦牛子宫肉阜上皮细胞。     

成年牦牛心室肌微血管床的形态学特征

对6头健康成年牦牛颈静脉放血致死并取出心脏,经左右冠状动脉同时灌注甲醛碳素墨水,再经40 g/L多聚甲醛水溶液充分固定,取心室组织块石蜡包埋、切片,光学显微镜观察,显微镜测微尺测量并照相。结果显示,牦牛心室微循环床中微动脉的直径小于100μm,以分叉状或梳状发出分支,走行多弯曲,呈蛇行状或螺旋状。终末微动脉管径均小于15μm。牦牛的毛细血管直径小于10μm。毛细血管之间形成H形或Y形的广泛吻合。吻合的毛细血管主要有3种不同的来源。牦牛微静脉的直径小于300μm,呈树根样结构。一条微静脉由若干条不同来源的毛细血管结合而成。牦牛心室肌中存在着动静脉吻合。     

三江白猪Hal基因型及其血液生化指标的测定

随机选取216头三江白猪,提取基因组DNA进行聚合酶链式反应,获得了氟烷基因(Hal)特异片段,测得其显性等位基因HalN的基因频率为92.13%,隐性等位基因Haln的基因频率为7.87%。然后对不同氟烷基因型三江白猪的14项血液生化指标进行了测定,结果表明:HalNHalN基因型三江白猪的葡萄糖含量、丙氨酸氨基转移酶活性与HalNHaln、HalnHaln基因型的相应指标之间差异显著(P<0.05),HalNHaln与HalnHaln两指标之间差异不显著(P>0.05)。3种基因型之间乳酸脱氢酶、天门冬氨酸氨基转移酶、胆碱酯酶、碱性磷酸酶活性以及总胆固醇、总胆红素、总蛋白、白蛋白、钙、磷、甘油三酯、肌酐含量差异显著(P<0.05)。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

青海省羊源细粒棘球蚴EG95基因的克隆与序列分析

从青海省羊源细粒棘球蚴中提取基因组DNA ,用EG95特异性引物进行PCR扩增 ,并克隆至 pGEM TEasy载体上 ,经PCR、EcoRⅠ酶切和测序鉴定后 ,用DNAstar软件对 3个克隆的DNA序列进行同源性分析。结果表明 ,EG95基因的 3个序列 (EG95 QH 1、EG95 QH 2和EG95 QH 3)的片段大小为 14 35～ 14 37bp ,与GenBank中的EG95基因同源性为 73.2 %～99.2 % ,差异集中在内含子区域。其中EG95 QH 1、EG95 QH 3与GenBankEG95XJ ag、EG95 4序列的同源性较高 ;EG95 QH 2与GenBank中EG95 1、EG95 2、EG95 3序列的同源性较高。研究结果表明 ,青海羊源细粒棘球蚴EG95基因的 3个序列为EG95基因家族的成员。     

J亚群禽白血病病毒Hrb-1和JL-2株囊膜基因的克隆及遗传分析

采用特异性检测J亚群禽白血病病毒的RT PCR方法 ,自哈尔滨市及吉林省患病鸡群中分离鉴定出 2株J亚群禽白血病病毒 ,分别命名为Hrb 1和JL 2。 2株病毒经SPF鸡胚成纤维细胞增殖 ,获取其前病毒DNA。采用依据原型毒株HPRS 10 3cDNA序列设计并合成的 1对引物 ,进行PCR扩增 ,得到了JL 2和Hrb 1的囊膜基因。分别构建了重组质粒 pMD18 T JL2 /env和pMD18 T Hrb 1/env。在对 2株病毒囊膜基因进行序列测定的基础上 ,将囊膜基因中 gp85和 gp37的核苷酸序列及其推导氨基酸序列与国际上不同的参照毒株以及国内部分分离株进行了比较分析 ,结果表明 ,JL 2和Hrb 1分别与美国病毒株adol hc 1和UD3有着较大的亲缘关系。     

鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白基因的遗传变异分析

对鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果表明,PSH株S基因由3 504个核苷酸组成,编码1条由1 167个氨基酸残基组成的多肽。S基因编码产物裂解后形成的S1和S2亚单位分别由541和626个氨基酸残基组成。PSH株S蛋白切割识别位点为精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸(RRFRR),与多数鸡传染性支气管炎病毒(IBV)切割识别位点相似(RRF/SRR)。与GenBank中其他冠状病毒毒株S基因的推导氨基酸序列相比较,PSH株与IBV参考毒株的同源性为79.3%~99.6%,而与其他冠状病毒包括火鸡蓝冠病病毒和SARS病毒的同源性均小于37.8%。表明,鸽源冠状病毒PSH株属于第3抗原群冠状病毒,且与IBV亲缘关系较近。     

鸡毒霉形体H3株TM-1基因的克隆与序列分析

对鸡毒霉形体内蒙古分离株H3 株的TM 1基因进行了克隆和序列分析。根据巳发表的MGS6株TM 1蛋白基因序列分析设计了 1对引物 ,以H3 株DNA为模板进行PCR扩增 ,得到约 0 .8kb的片段 ,将该产物克隆到pUCm T载体上 ,得到重组质粒。经Kieser法、质粒PCR法、PstⅠ单酶切等方法鉴定后 ,测定H3 株TM 1基因序列 ,并与已知S6株TM 1基因序列进行了比较 ,结果表明 ,MGH3 株与S6株TM 1基因核苷酸序列同一性为 96.5 7% ,氨基酸同一性为95 .42 %。这些结果为进一步研究MGH3 株的基因免疫和基因工程疫苗等奠定了基础