饮水染镉对雄性大鼠精子发生的影响

通过对性成熟及性未成熟雄性大鼠进行慢性饮水染镉,探究了镉对大鼠精子发生的影响,为镉对雄性大鼠生殖毒性作用及其机理的研究奠定理论基础。将30只雄性SD大鼠(性成熟)随机等分成5组,分别饮用镉的质量浓度为0、25、50、100和200mg/L的饮水,试验期为56d;将15只雄性SD大鼠(性未成熟)随机等分成3组,分别饮用镉的质量浓度为0、50和200mg/L的饮水,试验期为105d。试验期结束后观察大鼠的附睾尾重、附睾尾中精子活力、精子活率、精子密度、精子形态等指标的变化情况。结果显示,对于性成熟大鼠,100mg/L镉剂量组与对照组相比,上述指标显著下降(P0.05),200mg/L镉剂量组与100mg/L镉剂量组相比,上述指标极显著下降(P0.01);100mg/L镉剂量组的精子畸形率与对照组相比,呈极显著增加(P0.01)。对于性未成熟大鼠,50mg/L镉剂量组与对照组相比,上述指标显著下降(P0.05),200mg/L镉剂量组与50mg/L镉剂量组相比,上述指标极显著下降(P0.01);50mg/L镉剂量组的精子畸形率与对照组相比,极显著升高(P0.01)。结果表明,慢性饮水染镉对动物精子的发生具有毒性作用,可明显影响雄性动物的生育功能,且存在剂量效应和时间效应关系。     

蛋白基因产物9.5在高原黄牛与平原黄牛睾丸中分布情况的比较

为了探索蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)在不同海拔地区黄牛睾丸组织中的分布特征及其与生精功能的关系,采用免疫组织化学SP法观察了PGP9.5在平原地区和高原地区黄牛睾丸组织中的分布特点。结果显示,PGP9.5显著分布于平原黄牛和高原黄牛睾丸Leydig细胞中,间质血管周围或血管壁内为阴性,生精小管内初级精母细胞为阴性,其余生精细胞为阳性;PGP9.5在平原黄牛Sertoli细胞为强阳性表达,而高原黄牛阳性信号有所减弱,仅在Sertoli细胞顶部呈弱阳性表达;PGP9.5阳性信号高原黄牛和平原黄牛表达均在睾丸头和睾丸尾较强,睾丸体最弱。结论:PGP9.5在不同海拔地区黄牛睾丸生精小管及Leydig细胞中均有分布,表明PGP9.5影响精子发生和激素合成等生殖机能活动;PGP9.5在高原黄牛Sertoli细胞中的分布明显较平原黄牛弱,提示高原环境对睾丸生精功能有一定影响。     

雌性骆驼生殖组织β-防御素-1基因的克隆及其组织表达量的检测

从雌性骆驼输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA,根据已发表的骆驼β-防御素-1基因的cDNA序列设计合成引物,采用RT-PCR扩增出了骆驼β-防御素-1基因;将扩增产物克隆于pBlueselectT载体后进行了序列分析。以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参,对扩增的β-防御素-1基因进行琼脂糖凝胶电泳后,应用凝胶成像分析系统,推断出了不同组织中β-防御素-1基因的表达量。结果,从雌性骆驼生殖各组织上皮均获得了203 bp的β-防御素-1基因的扩增片段,且β-防御素-1基因在雌性骆驼生殖道各组织内的表达量不同。结果表明,β-防御素-1在雌性骆驼生殖组织的先天免疫中起重要作用。     

堆形艾美球虫广东株3-1E基因在毕赤酵母中的表达

以重组质粒pGEM-3-1E为模板,扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株3-1E基因(长度为529 bp),将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中,构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母,甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测,表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。     

L-PGDS基因在大鼠睾丸与附睾中的表达

选用 2月龄SD大鼠睾丸与附睾总RNA为模板 ,运用RT PCR和蛋白质印迹技术探讨了Lipocalin型前列腺素D合成酶 (L PGDS)基因在大鼠睾丸与附睾头、附睾体和附睾尾中的表达及其差异。结果表明 ,L PGDS基因在大鼠睾丸中没有表达 ,在附睾中有较强表达 ,附睾头表达量最高 ,附睾体次之 ,附睾尾最低 ,表达量存在差异。提示 ,L PGDS在精子成熟过程中起着一定的作用。     

β-防御素caBD-1 mRNA在骆驼组织器官中的表达

根据已知的骆驼 β 防御素caBD 1cDNA序列设计了 1对预计扩增产物为 2 0 3bp的引物 ,通过RT PCR检测骆驼的整个消化道黏膜、肝、胰腺、气管黏膜、肺、肾、膀胱黏膜、卵巢、子宫内膜、脾、淋巴结、心等器官内caBD 1mRNA的表达。结果显示 :caBD 1mRNA在整个消化道、气管、膀胱、子宫等管状器官内的黏膜层有表达 ,而在实质性器官如心、肝、胰腺、肺、脾、淋巴结、卵巢、肾中无表达。提示 ,骆驼体内的这种内生性抗微生物肽有助于骆驼的黏膜宿主防御     

牦牛同种移植炎症因子AIF-1基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法从成年麦洼牦牛脾中克隆到同种移植炎症因子AIF-1的编码基因,并研究了其在各组织中的表达模式.结果表明,AIF-1基因包含一个444 bp的完整阅读框,编码一由147个氨基酸组成的蛋白,推测其分子质量约为16.6 ku,与其他多种动物的AIF-1的氨基酸序列有89%～95%的同源性.RT-PCR半定量分析结果显示,AIF-1基因在麦洼牦牛的脾、肾中都有转录,在脾中表达水平相对较高,而在肝、乳腺、心、肌肉中未见明显表达.     

牦牛舌抗菌肽基因cDNA的克隆及其在生殖系统中的表达

为了解牦牛舌抗菌肽(LAP)基因序列的特征及其在生殖系统中的表达情况,采用RT-PCR法从牦牛睾丸、附睾组织中扩增LAP基因,重组到pMD19-TSimple载体中,进行了测序和序列分析,并应用RT-PCR检测了雌性牦牛生殖系统(卵巢、输卵管、子宫、阴道等组织)中LAPmRNA的表达。结果显示,克隆的LAP基因包含一195bp的完整开放阅读框(ORF),与牛LAP基因相似性达97.9%,该ORF编码的64个氨基酸含有β-防御素特征性结构,即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基;LAP在牦牛生殖系统上皮组织中均有表达。推测LAP在牦牛生殖系统的先天免疫中具有重要作用。     

芽孢杆菌CY1-3株碱性纤维素酶基因celC的克隆及其在大肠杆菌中的表达

芽孢杆菌CY1-3株基因组DNA经Sau3AⅠ部分消化后回收2~7 kb片段,构建了部分文库。通过刚果红染色鉴定,筛选出6个纤维素酶基因的阳性克隆子,经酶切鉴定为同一克隆子,命名为pGJc-1。经测序分析,该片段包含一个由1 593个核苷酸组成的开放阅读框(ORF),命名为celC。经推导,celC基因编码由一531个氨基酸残基组成的CelC蛋白。氨基酸序列分析表明,CelC蛋白的氨基酸序列与多种细菌的-β1,4-内切葡聚糖酶具有很高的同源性。粗酶液的SDS-PAGE分析表明,celC基因在大肠杆菌中所表达的CelC蛋白具有纤维素酶活力,其分子质量约为58 ku。     

比格犬β-防御素cBD1基因的原核表达与鉴定

为获得比格犬β-防御素cBD1基因的表达产物,根据GenBank中登录的犬β-防御素基因cBD1(canis familiarisβ-defensin-like peptide 1)的序列设计引物,提取比格犬睾丸组织总RNA,利用PCR扩增cBD1基因,然后将其克隆至pET-32a(+)载体,构建原核表达质粒pET-32a-cBD1,通过PCR、酶切鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导和His-Ni-resin纯化目的蛋白。经SDS-PAGE检测,获得了约28ku的表达产物,与预期大小的β-防御素cBD1的分子质量相一致。Westernblot分析表明,表达产物与抗His标签鼠单克隆抗体发生反应,显示重组蛋白获得了表达。结果表明,成功表达的cBD1为新型抗菌制剂的研制奠定了试验基础。     

仔猪睾丸组织体外培养方法的建立

以30日龄仔猪睾丸组织块为培养对象,应用飞利普TECNAI10电子显微镜对培养前后的生精细胞类别进行了观察,对培养后的组织块进行生精细胞分化程度鉴定,建立了仔猪睾丸组织生精细胞爬片体外培养模型。培养前后电镜观察及HE染色结果显示,培养前细胞种类主要有2种:支持细胞和精原细胞,有少数几个初级精母细胞;培养第20 d的睾丸组织块HE染色观察到3个精子细胞,电镜观察到2个精子细胞。证实,在没有添加睾酮的情况下,此培养体系能够提供睾丸组织块生精细胞分化所需要的条件,使非精子细胞类生精细胞减数分裂为精子细胞。     

牛趋化因子受体4基因的克隆表达及序列分析

采用RT-PCR技术,从被刺激诱导的牛外周血单个核细胞(PBMC)中克隆了牛趋化因子受体4(CXCR4)全长基因,并将CXCR4基因和CXCR4基因N端1～126 bp(CXCR4~(42aa))片段分别亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,命名为pGEX-4T-1-CXCR4、pGEX-4T-1-CXCR4~(42aa).获得重组菌株后,采用不同的IPTG浓度、不同诱导时间、不同温度和不同培养基等组合诱导表达这两种重组菌,其中pGEX-4T-1-CX-CR4~(42aa)重组菌获得了表达,并在37℃、IPTG浓度为0.8 mmol/L、诱导6 h时表达量最大,约占菌体总蛋白的45%,目的蛋白主要以包涵体的形式存在;而pGEX-4T-1-CXCR4重组菌未表达出目的蛋白.     

黄牛脑水通道蛋白4的表达及其对高原脑水肿的易感性

为了探讨黄牛对高原脑水肿的易感性,并为青藏高原养牛业提供参考,运用免疫组织化学SABC染色法并采用Image-Pro Plus 6.0软件,对成年黄牛大脑不同功能区水通道蛋白4(AQP4)的表达及分布特征进行了研究。结果显示,黄牛不同功能区脑组织中AQP4表达面积(S)和积分光密度(IOD)值的大小顺序为S扣带回>S中央前回>S丘脑>S尾状核,IOD扣带回>IOD中央前回>IOD丘脑>IOD尾状核,且扣带回和中央前回的S和IOD值均显著高于丘脑和尾状核(P<0.01)。结果证实,成年黄牛脑不同功能区、同功能区不同层及同功能区同层不同类型细胞对水的通透性及代谢功能存在较大差异,对脑水肿的易感性是不同的。     

牛源犬新孢子虫MAG1基因的克隆及原核表达

为了解牛源犬新孢子虫MAG1基因的免疫学特性,根据MAG1基因序列,设计并合成了1对用于扩增MAG1基因的引物。将PCR扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE结果显示,MAG1在大肠杆菌中获得了较高水平的表达,表达蛋白的分子质量为65ku。Western-blot结果显示,表达的MAG1蛋白可被牛源犬新孢子虫阳性血清特异性识别,表明该MAG1蛋白具有较好的反应原性。本研究为新孢子虫病疫苗及诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子基因的融合表达

将O型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子(GMCSF)成熟肽基因共同克隆到原核表达载体pGEX6P1中,转化RS21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白BoGMCSF/VP1在大肠埃希氏菌RS21中的高效表达,表达产物经SDSPAGE和Westernblotting分析,重组的蛋白质分子质量约为66ku,与预期大小相符。表达蛋白占菌体总蛋白的30%,表达产物以包涵体形式存在;包涵体提取物经变性复性,用透析方法提纯,得到高纯度的表达蛋白。     

牛轮状病毒VP7基因在昆虫细胞中的表达

利用PCR方法扩增出牛轮状病毒外衣壳蛋白VP7基因,经BamHⅠ+PstⅠ特异性酶切后,连接于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA中,成功构建了重组质粒pFastBacHTA-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素筛选和PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-VP7。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,成功扩增了VP7基因,大小为981bp,所表达的重组蛋白大小为40.4ku,与预期值相符,该蛋白能与牛轮状病毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛轮状病毒ELISA检测试剂盒奠定了物质基础。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法,以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因,克隆至pGEM-T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定,gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后,Western-blotting和ELISA分析结果表明,这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应,可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

H1N1亚型猪流感病毒HA基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的血凝素(HA)基因,测序后对HA基因进行了生物信息学分析。将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。诱导表达的HA融合蛋白分子质量约为94.0 ku,表达产物占菌体总蛋白的29.5%。经Western-blot分析证实可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。用纯化的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,成功筛选到2株针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体;ELISA结果表明,制备的SIV单克隆抗体ⅢF6A4C10与H1N1亚型SIV抗原具有特异的免疫反应性,为H1N1 SIV的鉴别诊断奠定了基础。