空肠弯曲菌质粒与其生物学特性的关系

对不同来源的空肠弯曲菌的质粒及其与菌株来源、生物型、致病性和耐药性的关系进行了研究。共检出大小分别为 1.9、2 .3、2 .6、5 .6、12 .6、33.0、82 .0和 10 8.0kb的 8种CCC型质粒 ,构成 7种质粒谱型。健康鸡源菌的质粒阳性率为 0 ;患病鸡源菌为 1.96 % ;患病猪源菌为 4 5 .8% ;健康羔羊源菌为 0 ;患病人源菌为 0。空肠弯曲菌的质粒用EcoRⅠ酶切后 ,1.9和 2 .3kb质粒的酶切谱随菌株来源的不同而异 ,其他 6种质粒的酶切谱没有差异。统计分析表明 ,空肠弯曲菌质粒的质粒谱型和酶切谱型与菌株来源、Lior生物型、致病性相关 (P <0 .0 0 1) ;也与对链霉素 (P <0 .0 0 1)、萘啶酸 (P <0 .0 5 )的耐药性相关 ;空肠弯曲菌对链霉素的耐药性与 2 .3kb的质粒有关 (P<0 .0 5 )。     

银黑狐空肠弯曲菌和致病性大肠埃希氏菌带菌状况的研究

对２２６只银黑狐粪便拭子进行空肠弯曲菌检查，共检出带菌狐１４只，其中成年公狐（４０只）、成年母狐（１２１只）、母仔狐（４０只）和公仔狐（２５只）分别检出３，８，２和１只，检出率依次为７．５％，６．６％，５．０％和４．０％，平均检出率为６．２％。对１８９只银黑狐粪便进行致病性大肠埃希氏菌检查，检出带菌狐３１只，其中成年公狐（１３只）、成年母狐（１２２只）、母仔狐（５１只）和公仔狐（３只），分别检出４，１８，８和１只，检出率依次为３０．８％，１４．８％，１５．７％和３３．３％，平均检出率为１６．４％；共检出致病性大肠埃希氏菌３４株，代表１５个血清型。对６９只银黑狐粪便检查，未检出Ａ～Ｆ群沙门氏菌及Ａ群Ⅰ、Ａ群Ⅱ、Ｂ群和Ｄ群的志贺氏菌。对一起３日龄仔狐死亡原因调查，证实是由肠道致病性大肠埃希氏菌Ｏ１１４Ｋ９０所致。     

空肠弯杆菌的分离与鉴定的研究

本文报道了从奶牛、产蛋鸡、屠宰场的猪、舍饲的绵羊和山羊的粪便及肠内容物分离空肠弯杆菌的试验结果。从肠内容物取样,猪分离率为32.61％;粪便材料,猪、鸡、奶牛、山羊和绵羊分别为26.47％,13.04％,9.76％,13.33％和6.82％。利用改良的布氏半固体培养基,接种新分离株后置37℃保存,解决了弯杆菌新分离株保存难题。5株新分离株分别于10、20、30和40天检查,全部存活,效果可靠。这一方法对分离鉴定弯杆菌时菌株的短期保存,具有实际的应用价值。     

空肠弯曲杆菌生物膜的体外形成及鉴定

采用结晶紫染色与正交试验相结合的方法,对空肠弯曲杆菌在不同温度、pH值、气体条件以及不同培养基条件下形成生物膜的能力进行了检测和比较;并以筛选出的最佳培养条件在盖玻片上形成的生物膜为对象,用光学显微镜及扫描电镜观察生物膜的结构。结果显示,在正常气体条件下培养1～3d,生物膜形成水平明显高于其他2种气体条件(P<0.01),4d后3种气体条件下的生物膜形成量均有增加,但3组间差异不显著,说明正常空气组分的条件更有利于生物膜的快速形成,而且37℃、正常空气条件下,在pH7.0的MH肉汤中培养5d,通过显微镜和扫描电镜观察,在盖玻片上可形成典型的、可观测的生物膜结构。     

猪囊尾蚴cDNA质粒表达文库的构建

从猪囊尾蚴中提取总RNA ,并分离出mRNA ,采用定向克隆方法 ,将猪囊尾蚴cDNA片段重组入质粒表达载体 pSPORT 1的NotⅠ和SalⅠ双酶切位点之间 ,构建了猪囊尾蚴cDNA表达文库。通过库容量鉴定 ,所构建的表达文库的容量为 2× 10 6 ;经含有IPTG和X gal的颜色选择平皿测定 ,其重组率为 10 0 %。     

微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库的构建

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体。经体外包装,成功构建了我国微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库,铺板测定原始库容量为4.5×105PFU,扩增后的滴度为7.2×1010PFU/mL。     

鸡法氏囊B淋巴细胞全长cDNA表达文库的构建

分离纯化了3～4周龄SPF雏鸡法氏囊B淋巴细胞的mRNA,通过琼脂糖凝胶电泳确定其质量,运用SMART技术合成第一链cDNA,LD-PCR合成第二链cDNA,经SfiⅠ酶切后定向导入真核表达质粒pEXP-Lib中,构建了全长cDNA表达文库。初级文库的库容量达1.98×105 CFU,扩增后的库容量为2.35×109CFU。PCR鉴定结果显示,文库的重组率约为100%,且插入片段分布于500～2 000bp之间。对随机挑选的22个克隆进行测序,其中20个与原鸡序列的同源性在97%以上,另外2个为未知序列。结果表明,构建的cDNA文库具备较高的库容量和重组率,为进一步筛选鸡传染性法氏囊炎病毒(IBDV)受体及感染相关基因奠定了良好基础。     

人和畜禽的空肠弯杆菌分离培养及带菌状况调查

对195例不同年龄腹泻病人的粪样及656只健康和腹泻畜禽的直肠和泄殖腔拭子进行空肠弯杆菌培养,总检出率为26.1%(222/851).人和畜禽的带菌率分别为健康蛋用鸡为61.0%(61/100),腹泻后备蛋用鸡为53.3%(40/75),健康后备蛋用鸡为22.0%(11/50),腹泻仔猪为88.0%(88/100),健康羔羊为5.7%(6/106),牦牛犊为12.4%(15/121)和0(0/104)腹泻病人为0.5%(1/195).蛋用鸡各组间的带菌率差异极显著(P＜0.01),腹泻后备蛋用鸡的带菌率明显高于健康后备蛋用鸡(P＜0.01),显示后备蛋用鸡腹泻与该菌感染相关.腹泻仔猪的带菌率很高,也提示该菌感染与仔猪腹泻存在一定关系.噻孢霉素对空肠弯杆菌检出率的影响和抗生素药敏性试验结果表明,噻孢霉素不能替代头孢霉素Ⅰ,而头孢哌酮钠(头孢必)可取代Camp-BAP琼脂中的头孢霉素Ⅰ.在100mL/LCO2气体环境中微需氧培养比烛缸内培养空肠弯杆菌检出率高13.0%,显示分离该菌以100mL/L CO2法明显优于烛缸法(P＜0.01).     

畜禽空肠弯杆菌分离培养的影响因素

比较观察了空肠弯杆菌分离培养中微需氧法、培养时间、采样时机、运送时间、运送培养基、增菌培养法以及噻孢霉素和头孢哌酮钠等因素对该菌检出率的影响。结果表明 ,在 10 0mL/LCO2 气体环境中微需氧培养比烛缸内培养空肠弯杆菌检出率高 13 .0 % ,即显示 10 0mL/LCO2 法明显优于烛缸法 (P <0 .0 1) ;空肠弯杆菌分离培养时间以 48h即可 ,无须延长培养时间 ;产蛋鸡采样时机为产蛋前 ;检样运送时间、运送培养基和增菌培养后对空肠弯杆菌检出率的影响不明显(P >0 .0 5 ) ,用单一的一种分离培养方法不能反映动物的实际带菌水平 ;噻孢霉素对空肠弯杆菌检出率的影响和抗生素药敏性试验结果表明 ,噻孢霉素不能替代头孢霉素Ⅰ ,而头孢哌酮钠可取代Camp BAP琼脂中的头孢霉素Ⅰ。     

空肠弯杆菌肠毒素细胞检测法的建立

中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ），非洲绿猴肾细胞（Ｖｅｒｏ），人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａ）和乳仓鼠肾细胞（ＢＨＫ－２１）４种细胞对空肠弯杆菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）细胞紧张性肠毒素（ＣｙｔｏｔｏｎｉｃＥｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ，ＣＥ）的敏感性试验表明，ＣＨＯ细胞对ＣＥ敏感；ＣＨＯ细胞与大鼠肠袢试验比较检测ＣＥ，以ＣＨＯ细胞对ＣＥ最敏感；试验发现布氏肉汤对细胞有毒性作用，确定了以Ｍ１９９＋１０ｇ／Ｌ胰蛋白胨培养基进行空肠弯杆菌产生ＣＥ的培养方法，依次建立了ＣＥ的ＣＨＯ细胞检测法。     

空肠弯杆菌肠毒素的组分及其分子质量测定

经ＳＤＳＰＡＧＥ分析发现,８０％饱和硫酸铵盐析的空肠弯杆菌细胞紧张性肠毒素（ｃｙｔｏｔｏｎｉｃｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ,ＣＥ）粗提物除有６８ｋｕ的１条带外,还有部分未分开的小分子物质,而经神经节苷脂ＧＭ１亲和层析后仅有６８ｋｕ的１条带,表明ＣＥ为６８ｋｕ的蛋白质。     

副鸡嗜血杆菌基因文库的构建与筛选

为了筛选副鸡嗜血杆菌的体内表达基因,提取了副鸡嗜血杆菌的全基因组,构建了副鸡嗜血杆菌基因组的pET系统表达文库。运用PCR及核酸内切酶(SalⅠ+NdeⅠ)鉴定基因文库,并以病原菌吸附后的康复血清作为探针,采用菌落原位杂交的方法对基因文库进行筛选。结果显示,重组质粒中有0.5～2kb的片段插入,99%的基因包含在基因文库中;重复筛选后得到的阳性克隆再经过PCR与SalⅠ+NdeⅠ酶切鉴定后定向测序,并对测序结果在NCBI上进行分析后发现筛选获得的基因中,有1个表达为转运谷氨酰还原酶、1个表达为转录终止因子,1个表达为荚膜合成域2,还有2个表达为保守假想蛋白。结果表明,本研究应用体内诱导抗原技术(IVIAT)筛选到了一些副鸡嗜血杆菌体内诱导表达基因,并对基因的功能做了初步探讨,在找寻副鸡嗜血杆菌在体内生存以及致病关键基因的道路上前进了一步,为传染性鼻炎的预防和治疗积累了有价值的资料。     

中国猪瘟兔化弱毒全基因组cDNA文库的构建和序列分析

根据已发表的猪瘟病毒 (CSFV)序列设计并合成了 2 6条覆盖全长基因组的套式和半套式PCR引物。应用RT PCR、NestedPCR和Half nestedPCR技术从试验感染的兔脾中成功地扩增出了各相应的cDNA重叠片段 ,分别克隆和测序 ,构建了C株全基因组cDNA文库。采用DNAstar软件对全基因组的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性比较分析。CS FVC株全基因组cDNA文库的构建为进一步构建全长感染性cDNA奠定了基础