弓形虫单克隆抗体试剂的研究——单克隆抗体微量反向间接血凝试验

本文首次报道用杂交瘤细胞株3C_2分泌的抗弓形虫单克隆抗体腹水经饱和硫酸胺盐析纯化后致敏绵羊红细胞而建立了弓形虫微量反向间接血凝试验。结果表明:它可检测出含量仅为5μg/ml的弓形虫速殖子可溶性抗原,并且在弓形虫QHO株速殖子感染绵羊和家兔之后的2～6天,血清中即能检测到循环抗原;与正常绵羊、家兔和小白鼠的血清以及其它寄生虫感染的动物血清无非特异性反应和交叉反应;试剂经冷冻真空干燥处理后其活性不受影响,且至少能保存3个月之久。从而为早期弓形虫感染和现症急性感染等提供了一种特异性强、灵敏度较高和简便实用的诊断方法。     

用氯化铬联结病毒与绵羊红细胞的被动血凝试验

建立的用低浓度氯化铬溶液作联结剂将蛋白质抗原联结于绵羊红细胞表面，用于被动血凝试验（ＰＨＡ）的方法显示，绵羊红细胞在联结前用０．２５％胰酶处理，可显著提高抗原与红细胞的联结效力；用联结蛋白相对应的抗血清检测，滴度可达１：２６２１４４０；被联结蛋白浓度由前人试验所获得的最低３ｍｇ／ｍｌ降低到０．２ｍｇ／ｍｌ，从而可用于低蛋白浓度的病毒的联结。     

马动脉炎病毒血凝抑制试验研究及其应用

用马动脉炎病毒(EAV)免疫SPF豚鼠,4周后采血做血凝抑制试验(HI),其抗血清可以抑制血凝抗原对小鼠红细胞的凝集反应,抗原和抗血清在4℃感作24 h后可以检测到最高的HI抗体效价,同时结果显示HI抗体与中和抗体产物呈正相关.对561份来自新西兰、吉尔吉斯、沙特阿拉伯及内蒙古、新疆的马血清用HI试验和微量血清中和试验(NT)进行EAV抗体检测,HI和NT阳性符合率为94.7%,血凝抑制抗体与中和抗体效价呈显著的正相关.     

动物类人乙型肝炎的调查

作者采用人的乙型肝炎ELISA诊断试剂盒检测动物的乙型 肝炎。结果HBsAg检测黄牛血清43份,阳性率为2.3％(1/43); 肝浸液43份,阳性率为27.9％(12/43);肌浸液43份,阳性率为9.3 ％(3/43);鸡血清72份,阳性率为12.5％(9/72);牛奶37份,阳性率为10.8％。HBeAg检测黄牛血清43份,未检出阳性;肝浸液43份,阳性率为11.6％(5/43);肌浸液43份,未检出阳性;鸡血清72份,阳性率为2.8％(2/72)。其结果表明黄牛、鸡、奶牛均感染类人乙型肝炎病毒,并广泛存在于肝脏、血液、肌肉及牛奶中。     

猪传染性胃肠炎病毒的血凝作用

将猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）Ａ株在ＩＢＲＳ２细胞上增殖，培养物经差速离心浓缩后与鸡红细胞出现了高凝集价（２８），这种凝集作用能被兔抗ＴＧＥＶ高免血清所抑制。试验的最适反应条件为体积分数０．５０％红细胞４℃作用１ｈ。通过反复试验，建立了一种简单实用的血凝抗原制备方法，病毒培养液不需浓缩可直接应用。     

马动脉炎病毒的血凝性研究

在RK-13细胞上培养的马动脉炎病毒(Equine viral arteritis,EAV)在4℃、室温和37℃条件下,用多种动物的红细胞进行血凝试验,病毒在不同温度下均可凝集小鼠和鸡的红细胞,但不能凝集牛、绵羊、山羊、马、猪、豚鼠、仓鼠、兔及鹅的红细胞.将病毒用吐温-80和乙醚处理后,血凝活力会显著增强,其HA效价比未经处理的病毒高4-8倍,且血凝像更加清晰.处理病毒的最适条件是在冰浴状态下用终浓度0.6-1.25 mL/L吐温-80振荡处理15-60 min,再加1/2体积的乙醚振荡作用5-15 min.     

犬细小病毒血凝抑制抗体和中和抗体的关系

对8份犬细小病毒免疫的犬血清同时进行中和(SN)抗体和血凝抑制(HI)抗体检测.结果,SN抗体和HI抗体具有正比线性关系,SN抗体近似于6倍HI抗体.其中HI抗体检测可在3 h内获得结果,操作简便,通过测定HI抗体效价即可推算出SN抗体的效价.     

牛嗜肝DNA病毒的研究——利用RIA和ELISA在牛奶中检出HBsAg相关抗原

分别利用人乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）放射免疫测定（ＲＩＡ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）对某奶牛场４０份牛奶样本进行了测定，结果在样本低稀释时有５份呈现阳性或可疑。肯定了我国牛群中存在新的嗜肝ＤＮＡ病毒种。牛奶中的ＨＢｓＡｇ相关性抗原与人ＨＢｓＡｇ的交叉反应性较低，这同其它哺乳动物嗜肝ＤＮＡ病毒与人乙型肝炎病毒的低同源性相一致。     

绵羊棘球蚴囊液抗原在IHA中的特异性研究

本研究应用粗制绵羊包囊液作抗原致敏经戊二醛处理的鞣酸化绵羊红细胞,进行微量间接血凝试验(IHA),检测棘球蚴病羊血清400份、健康羊血清45份、细颈囊尾蚴病羊血清13份、肝片吸虫病羊血清21份、边虫病羊血清20份、多头蚴病羊血清1份,阳性反应率依次为83.1％、13.33％、33.46％、4.35％、0％、0％。以40％饱和硫酸铵盐析抗原对上述健康羊血清、细颈囊尾蚴病羊血清及96份棘球蚴病羊血清的检测结果依次为13.33％、38.46％、87.5％。对分段盐析的其他组份及葡聚糖凝胶层析抗原、醋酸盐析抗原、牦牛肺包囊液抗原、鼠包囊液抗原也进行了初步试验,均未获得满意结果。     

兰州地区孕妇和新生儿弓形虫感染状况的血清学调查

采用间接血凝试验测定了兰州地区５８０例孕妇和６１４例新生儿血清中弓形虫抗体，同时进行了１６６对母血和新生儿脐带血的配对测定。结果５８０例孕妇中，弓形虫抗体阳性者３４例，阳性率为５．８６％．其中效价为１：６４者有２３例，１：２５６者４例，１：１０２４者５例，１：４０９６者２例。６１４例新生儿中抗体阳性者３２例，阳性率为５．２１％。其中抗体效价为１：６４者１５例，１：２５６者９例，１：１０２４者８例。１６６对母婴配对血测定结果，母血抗体阳性率为４．８２％，脐带血阳性率为５．４２％，母婴血均阳性者６对，占３．６１％。实验结果提示，兰州地区孕妇存在一定程度的弓形虫感染；新生儿也存在先天性弓形虫感染。     

屠宰猪肝和血清中乙型肝炎病毒及戊型肝炎病毒的检测

应用1对乙型肝炎病毒(HBV)S基因保守区的引物,采用PCR方法从屠宰猪肝、血清中检测到了HBV,序列分析表明,扩增片段与已发表的HBV S基因的同源性高达98%~100%。电镜负染色样品观察结果表明,在HBV表面抗原ELISA检测强阳性反应的血清样品中存在有形态、大小与人HBV Dane颗粒和小球状颗粒相似的病毒粒子。针对戊型肝炎病毒(HEV)ORF2/ORF3重叠区设计了简并引物,采用巢式RT-PCR对屠宰猪肝和血清样品进行了检测。结果表明,部分屠宰猪肝中存在HEV。     

耕牛巨盘腹袋吸虫感染情况调查

对贵州省３８个县６３３个乡（镇）的１１２１头耕牛（黄牛３６６头，水牛７５５头）用蠕虫学局部剖检法在其中４５头牛的瘤胃内检出巨盘腹袋吸虫（Ｇａｓｔｒｏｔｈｙｌａｘｍａｇｎａｄｉｓｃｕｓｓｐ．ｎｏｖ．），总感染率为４．０１％，在不同性别的黄牛、水牛无显著差异，而与年龄呈正相关。该吸虫的感染有明显的季节性和地域性，主要分布于潮湿低洼地区。另剖检７６８只山羊和９１只绵羊，均未发现该吸虫感染     

口蹄疫病毒持续感染的研究进展

从口蹄疫病毒和其宿主两个方面综合阐述了口蹄疫病毒持续感染形成的原因,旨在为进一步阐明口蹄疫病毒持续感染的机理和降低持续感染对口蹄疫防控存在的威胁提供理论依据。     

贵州省猪戊型肝炎的分子流行病学调查

采集贵州省戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)抗体阳性的6个猪场新鲜猪粪便样品216份,提取RNA,通过RT-nPCR扩增HEV ORF2基因,对阳性PCR产物进行克隆和测序,采用MEGA5.05软件进行序列比对,构建系统发生树,并经流行病学分析,调查了贵州省猪群的HEV感染情况及基因型。结果显示,HEV主要感染1月龄以上的未成年猪群;粪样采集的6个猪场均不同程度(5.88%～56.52%)地检出HEV RNA阳性,总体阳性率为22.69%(49/216),场群阳性率为100%(6/6);不同类型猪场(养殖户型和养殖场型)HEV RNA阳性率(分别为41.10%和13.29%)差异具有统计学意义(P<0.01),养殖户之间及养殖场之间的阳性率差异无统计学意义(P>0.05),但随着饲养时间的延长,这2种类型猪场的粪便HEV RNA检出率呈上升趋势;测序36个PCR阳性分离株(占73.5%),序列一致性为91.1%～100%,与HEV禽型及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的一致性分别为52.4%～55.4%、75.2%～77.9%、73.6%～75.9%、72.7%～79.1%、83.2%～95.6%,系...     

鸭病毒性肝炎病毒RNA聚合酶在真核细胞中的表达及亚细胞定位

为研究鸭病毒性肝炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶的分子生物学特性及其在细胞中的定位,构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒;然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和蛋白免疫电泳试验等方法检测了RNA依赖性RNA聚合酶在细胞中的表达和亚细胞定位情况。结果表明,RNA依赖性RNA聚合酶能与增强型绿色荧光蛋白一起在MDCK细胞中良好表达,且主要分布于细胞核中,Western-blot分析结果显示,融合蛋白在80ku处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性。表明成功构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现RNA依赖性RNA聚合酶主要在细胞核中发挥复制酶的功能。     

1型鸭肝炎病毒E53株和HP-1株全基因组序列分析

根据已发表的1型鸭肝炎病毒(DHV-1)基因组序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法对DHV-1 E53株和HP-1株的基因组序列进行分段扩增并测序.BLAST分析确定为DHV-1型基因组序列,GenBank登录号分别为EF151313和EF151312.E53株与已发表的参考毒株的核苷酸同源性为94.6%～99.4%;HP-1株与已发表的参考毒株的核苷酸同源性为94.4%～99.6%.系统进化树分析结果表明,E53株与北京BJ株进化关系最近;HP-1株与R85952株进化关系最近.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒间接免疫酶染色检测方法的建立

以蔗糖密度梯度离心提纯的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)免疫兔制备兔抗DHV-Ⅰ抗体,建立了检测石蜡组织切片中DHV-Ⅰ抗原的间接免疫酶染色(indirect immunoperoxidase staining,IIS)方法,并对DHV-Ⅰ强毒人工感染死亡或濒死雏鸭的各个组织器官进行了检测。结果表明,IIS与DHV-Ⅰ感染死亡或濒死雏鸭的肝等呈现阳性反应,与鸭瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭的肝以及健康雏鸭的肝呈现阴性反应。感染DHV-Ⅰ死亡或濒死雏鸭的肝、脾、肾、心、胸腺、腔上囊、胰腺、十二指肠、盲肠、空肠、回肠、直肠的免疫组织化学检测呈阳性或强阳性,DHV-Ⅰ抗原主要分布于感染细胞的细胞质。该IIS法具有良好的特异性,可用于DHV-Ⅰ在感染雏鸭组织细胞中的亚细胞定位、DHV-Ⅰ感染雏鸭的实验室诊断、甲醛固定组织的回顾性诊断。     

禽腺联病毒序列对鸡输卵管细胞表达人溶菌酶基因的促进作用

将鸡卵清蛋白基因5′-调控区控制的人溶菌酶(hLYZ)cDNA表达盒插入禽AAV末端反向重复序列之间,将CMV启动子控制的rep表达盒插入其下游,获得的表达载体pRep2ITR-OV4-LYZ用聚乙烯亚胺包裹,经翅静脉注射产蛋鸡,待蛋清中rhLYZ表达水平下降至注射前水平时,用pRep2ITR-OV4-LYZ进行3次重复注射,以RBB-R染料标记比色法和Western-blotting检测蛋清中rhLYZ表达,以细菌生长抑制试验检测rhLYZ活性。结果,在相同试验条件下,pRep2ITR-OV4-LYZ表达rhLYZ的水平和时间优于不含禽AAV序列的pOV4-LYZ,rhLYZ表达水平和时间随载体注射次数增加呈上升和延长趋势,rhLYZ的分子质量与天然hLYZ相同,对致乳牛乳腺炎大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌具有显著的抑制作用。试验结果提示,禽AAV ITR和rep序列能促进hLYZ基因在鸡输卵管细胞中正确表达。     

河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒隐性感染情况的调查

为了解河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的隐性感染情况,采用RT-PCR方法对2006-2009年采自全省11个地市228个县级屠宰场1 565份商品猪的肺或肺门淋巴结样品进行了PRRSV病原学检测。结果显示,PRRSV场总体阳性率为45.18%;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)样品总阳性检出率为12.08%,这4年样品的阳性检出率分别为28.45%、40.74%、12.01%和7.31%;经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)样品总阳性检出率为2.36%,这4年样品的阳性检出率分别为3.45%、3.70%、3.92%和1.46%。PRRSV同猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型混合感染所占的比率为59.73%,HP-PRRSV和C-PRRSV同其他病原体混合感染所占的比率分别为57.67%和43.24%,混合感染以二重或三重感染为主。在同一份样品中不能同时检测到HP-PRRSV和C-PRRSV。总之,PRRSV,尤其是HP-PRRSV在河北省猪群中隐性感染的现象普遍存在,值得高度重视。     

乳牛衣原体病灭活疫苗的研制

将免疫原性稳定的鹦鹉热衣原体SX5菌株灭活,加入油佐剂制备乳牛衣原体病灭活疫苗,并对疫苗的安全性进行了检测。用该疫苗对成年牛和犊牛进行了最小免疫量试验、效力试验和免疫持续期试验;结果表明,最小免疫量分别为3 mL和5 mL,平均免疫保护率达94．4％,免疫持续期达10个月。疫苗保存期试验表明,在4℃条件下可保存12个月。本动物安全试验和田间小试免疫证明,该疫苗安全性好,乳牛注射疫苗后饮食、产乳量及注苗部位没有明显的异常变化。