Ⅰ型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种能同时检测Ⅰ型鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus typeⅠ,DHV-Ⅰ)和鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)的检测方法,根据Gen Bank中DHV-Ⅰ和DPV的基因保守序列,设计合成两对特异性引物,扩增得到DHV-Ⅰ和DPV片段,大小分别为399 bp和232 bp。据此建立了双重PCR检测方法,并将反应条件进行了优化。结果显示,该方法特异性强,能同时扩增出DHV-Ⅰ和DPV目的条带,而对其他常见的水禽病病原的扩增结果均为阴性。该方法灵敏度高,最低能检出5.3 pgⅠ型鸭肝炎病毒和2.7 pg鸭瘟病毒的RNA或DNA。采用该方法对在江苏省徐州地区所采集的166份鸭肛拭子进行检测,DHV-Ⅰ阳性率为1.2%;DPV阳性率为26%。同时,利用该方法对建立的DHV-Ⅰ和DPV雏鸭感染模型的肝组织和肝组织接种的鸭胚尿囊液进行检测,结果均为阳性,与常规PCR和RT-PCR检测结果一致。上述结果表明。本研究建立的一步法二重RT-PCR方法可以用于DHV-Ⅰ和DPV快速准确的诊断。     

鹅感染鸭瘟的诊断

鹅感染鸭瘟的诊断黄宏菁（海南省万宁县畜牧业局５７１５００）６０年代初，国内外曾有鹅感染鸭瘟病毒而引起流行的纪录。但海南地区至今未见类似报道。近日，在本县某养鹅专业户的鹅群发病过程中，经一系列诊断，证实是鹅的鸭瘟，经紧急接种１０倍鸭免疫量的鸭瘟弱毒疫苗...     

PCR检测鸭瘟病毒的研究

根据鸭瘟病毒DNA聚合酶基因序列 ,设计、合成了 1对引物 ,以 1株鸭瘟病毒疫苗株DNA为模板 ,进行PCR扩增 ,扩增出预期 5 6 3bp的目的DNA片段。将扩增出的DNA片段克隆到pMD18 T载体 ,经Amp/IPTG/X gal平板筛选 ,HindⅢ、XbaⅠ双酶切鉴定 ,获得阳性重组质粒。对重组质粒进行序列测定 ,与参考序列比较 ,二者同源性为 99.3%。小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鹅副黏病毒PCR扩增均为阴性。用此方法检测人工感染和自然感染鸭瘟的组织 (脑、肝、脾 ) ,均能检测到鸭瘟病毒DNA。PCR检测鸭瘟病毒具有高度的特异性、敏感性 ,能够用于鸭瘟急性及亚临床感染的检测与诊断     

检测鸭甲型肝炎病毒3型的免疫组织化学方法的建立和应用

收集鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV3)接种10日龄鸭胚后死亡胚体的尿囊液,用差速离心法获得纯化的DHAV3抗原免疫家兔后制备家兔抗DHAV3超免疫血清,提取家兔抗DHAV3IgG,成功建立和优化了检测DHAV3的免疫组织化学方法。该法能够检测DHAV3感染雏鸭肝组织的病毒抗原,阳性信号主要分布于受感染细胞的细胞质,而用它检测鸭瘟病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病死亡雏鸭和健康雏鸭时则呈现阴性反应。应用该方法对临床确诊并经福尔马林溶液保存的5份DHAV3感染雏鸭的肝、脾、肾、小肠、法氏囊、哈氏腺、胸腺的样品进行检测,结果均为阳性。以上试验结果表明,该方法具有良好的特异性,可用于DHAV3感染雏鸭的临床诊断和福尔马林溶液固定样品的回顾性诊断。     

基因枪轰击注射鸭α-干扰素基因疫苗对免疫鸭抗鸭瘟强毒感染的影响

将鸭α-干扰素基因疫苗pcDNA-SDIFN-α分别按每只1、3和6μg剂量采用基因枪轰击方式免疫樱桃谷鸭,以PBS、空载体质粒pcDNA 3.1( )和鸭瘟弱毒疫苗为对照,注射后第15 d给每只鸭人工感染鸭瘟强毒。结果显示,1μg pcDNA-SDIFN-α免疫鸭有3/12死亡,PBS和空载体注射鸭分别有5/12和4/12死亡;3μg和6μg pcDNA-SDIFN-α免疫鸭以及鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭100%受到保护。3个剂量pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量显著低于PBS和空载体对照组,而3个pcDNA-SDIFN-α免疫组之间差异不显著。表明,基因枪轰击pcDNA-SDIFN-α免疫鸭后能产生一定的抗鸭瘟强毒感染的作用。     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1/R1和GPVF1/R1,建立了一种PCR方法,用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒(DPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、犬细小病毒(CPV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果,引物MDPVF1/R1仅特异性扩增出MDPV的900 bp核酸片段,引物GPVF1/R1仅特异性扩增出GPV的465 bp核酸片段。表明,建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。     

鸭瘟的诊断与防治

1999年 11月 ,河南省濮阳市某专业户饲养的 2 0 0 0只产蛋鸭发生了一种以肿头、流泪、两脚麻痹、排绿色稀粪和产蛋量下降为特征的疾病 ,根据临床症状、病理变化、实验室检验 ,确诊为鸭瘟。1　临床症状1999年 11月 2 2日 ,该专业户的鸭群中死亡 8只鸭 ,其中 6只死亡鸭有肿头症状。鸭群中部分病鸭精神萎靡 ,两脚发软 ,行动困难 ,有的病鸭下痢、排绿色稀粪和产蛋量下降。2　病理变化对死亡鸭和发病鸭剖检 ,其口腔及食道内有黄色分泌液 ,粘膜上有数量不等的灰黄色伪膜 ,剥离伪膜后有溃疡病灶 ;肝微肿、有出血斑点 ;卵泡变形 ,卵泡膜充血。3　实…     

鸭肺炎克雷伯氏菌病的诊疗

(一)发病经过 1987年3～4月,富民某鸭场及昆明某鸭场从外地分别引进狄高鸭5000余只,北京鸭1800余只,前者先后发病3000余只,发病率为60％,死亡1200多只,致死率40％;北京鸭发病1000余只,发病率55.56％,死亡200余只,致死率20％。在10～15天曾使用过鸭瘟疫苗免疫,四环素、土霉素治疗,均未得到控制。 (二)临床症状 病鸭食欲减少、呼吸困难、喘气、拉黄绿色稀粪。后期废食、精神沉郁,翅膀下垂、羽毛松乱、缩颈、眼半闭、呆立不动、呼吸加快,胸腹起伏明显,达80次/分以上。有的不时发出呜叫,声音沙哑,抬头伸颈,张口呼吸、眼鼻有浆液性鼻液,排黄绿色稀粪,头向上向后弯曲,因呼吸困难,窒息而死。     

鹅卵内小鹅瘟琼扩抗体的检测

鹅卵内小鹅瘟琼扩抗体(GP—AGP)的检测,迄今尚未见有报道。为此我们对鹅卵内GP的AGP抗体检测技术作了探索,并进一步应用于免疫母鹅及流行地区鹅卵黄内AGP抗体的检测。现报道于后。 (一)材料及方法 1.毒种:①小鹅瘟鸭胚适应毒W株,系我们在一次小鹅瘟爆发病例中分离获得,强迫适应鸭胚,其7代毒对鸭胚ELD_(50)为4.5/0.3ml;②GD株小鹅瘟弱毒株,由佛山兽医专科学校陈伯伦提供。     

雏鸭病毒性肝炎的诊断与防治

雏鸭病毒性肝炎(DVH)最早(1949年)发现于美国纽约长岛,这次大流行使75万只雏鸭死亡。此后逐渐扩大传播到英国、加拿大、联帮德国、意大利、荷兰、苏联、捷克、匈牙利、埃及、印度、日本等国。在我国,黄均建(1963)最早报道本病曾发生于上海某些鸭场;以后王平等(1972)、吴成等(1981)、谭振国等(1986)、李劲松(1987)和蒋文灿等(1989)分别报道北京、福建、广东、江苏和四川等地都有此病发生,并证明其血清型为Ⅰ型。     

鸭短喙型小鹅瘟病毒SBDS-GPV JS01株的分离鉴定及其对雏鸭致病性的研究

2018年以来,江苏地区部分养殖场病鸭表现短喙、生长延滞。为确定该病的病原特征,本研究团队从某发病樱桃谷肉鸭场采集病料,经无菌处理后接种11日龄鸭胚连续传代培养,分离获得1株病毒,传至第3代次时可致感染鸭胚死亡,第5代次病毒滴度达5.3 log_(10)ELD_(50)/mL。通过PCR鉴定、电镜观察、基因遗传进化分析和动物回归试验,证明该毒株是短喙型小鹅瘟病毒(short beak and dwarfism syndrome-goose parvovirus,SBDS-GPV),遂将其命名为SBDS-GPV JS01株。为了进一步研究SBDS-GPV JS01株对不同品种鸭的易感性与致病力,将该毒株第5代病毒分别经皮下接种1日龄GPV阴性健康高邮鸭、金定鸭与苏邮1号鸭。结果显示,JS01株对各品种试验鸭均易感,感染鸭出现发育迟缓、腹泻、跛行瘫痪及上下喙萎缩变短等临床症状,发病率100%,死亡率10%～25%。上述结果表明,本研究成功分离鉴定出1株SBDS-GPV,该毒株具有较广的宿主感染谱。     

鸭γ干扰素在体外细胞中抗鸭肠炎病毒作用的研究

为初步探究鸭γ干扰素(IFNγ)抗病毒作用,本研究从鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblast,DEF)中扩增出鸭γ干扰素(IFNγ) cDNA。将鸭IFNγ基因分别与真核表达载体PCAGG及原核表达载体p ET-32a连接,获得重组质粒PCAGG-IFNγ及pET-32a-IFNγ。转染PCAGG-IFNγ于DEF细胞后第24小时,接种鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)。同时将pET-32a-IFNγ在大肠杆菌原核表达系统中进行蛋白表达,并用纯化产物处理DEF细胞,处理后第24小时接种DEV,分别采用Western-blot、TCID50测定方法和荧光定量PCR检测重组蛋白IFNγ对DEV复制的影响,并检测细胞中相关干扰素刺激因子(interferonstimulated genes,ISGs)基因包括抗黏液病毒基因(Myxovirus resistance,Mx)、泛素样2′-5′寡聚腺苷酸合成酶基因(2′-5′oligoadenylatesynthetases-like,OASL)、DEAD框蛋白50基因(DEAD-box protein 50,DDX50)的表达情况。结果发现,无论是真核表达的还是原核表达的重组IFNγ均能抑制DEV的复制,并引起ISGs基因表达的上调。本研究结果为进一步探索鸭IFNγ的抗病毒机制提供了基础数据。     

熊猫犬瘟热病的临床观察与防疫措施

犬瘟热病是危害犬科动物的一种急性病毒性传染病,大熊猫科、浣熊科等动物亦易感染。1982年春某动物园大熊猫发生了犬温热,相继熊猫馆的4只熊猫全发病,先后在一个月内死亡。后经中国农业科学院哈尔滨兽医研究所和南京农学院等单位作病原检查诊断为熊猫犬瘟热病。现将临床症状与预防措施报道如下: (一)发病情况 熊猫展出后,于当年2月初原有癫(疒间)病史的大熊猫首先出现似癫(疒间)症状,相继大小熊猫全发病,症状基本相同,病程5～7天死亡。 (二)临床病状 病初患兽异常兴奋,乱冲乱撞,有时可发出尖叫声,四肢僵硬,步态跄踉,运动失     

应用间接免疫荧光法检测新型鸭瘟病毒

采用人工方法给雏鸭和成鸭攻击新型鸭瘟病毒 (NDPV) ,攻毒后于不同时间采样 ,对不同脏器进行间接免疫荧光法检测 ,确定了最佳采样检测时间和病毒在多种脏器内的定位 ,并对其致病力、致病时间、交叉检测结果等与鸭瘟病毒 (DPV)进行了对比。结果表明 ,NDPV对雏鸭致病力较强 ,病毒含量以肝、脾最高 ,其次为血液、脑、鼻腔分泌物 ;NDPV和DPV与它们的对应超免疫血清之间有交叉反应 ,但阳性较弱 ;冰冻切片制成的抗原片阳性检出率明显高于压印片     

鸭瘟病毒CY07株诱导的细胞凋亡及凋亡对其增殖的影响

通过荧光染色对鸭瘟病毒(DPV)CY07株诱导的细胞凋亡进行了测定,并通过real-time PCR测定了其在鸭胚成纤维细胞上的增殖规律,探讨了DPV CY07诱导鸭瘟发生的机制.结果显示,DPV CY07株诱导鸭胚成纤维细胞凋亡的凋亡率于接毒后第12 h时达到峰值12.85%,对照毒株鸭瘟标准毒诱导的细胞凋亡在接毒后第8 h达到峰值10.57%.DPV CY07株的数量在接毒后第20 h开始急剧增加,至第24 h增幅为102.02;鸭瘟标准毒的数量在接毒后第16 h开始急剧增加,至第24 h增幅为102.21,且试验结束时DPV CY07株的病毒量低于鸭瘟标准毒株.说明,DPV CY07株诱导细胞凋亡的能力较强,这可能是其毒力强的主要原因.     

东北地区发生鸭瘟

1985年1～2月,辽宁、吉林等省部分地区鸭群发生一种疫病,经流行病学调查、临床观察、病理解剖、实验室检查和免疫学试验,确诊为鸭瘟。 (一)流行病学调查 据文献记载,鸭瘟是我国南方鸭群的常发病,北方罕见。辽宁、吉林等省为发展养鸭事业,于1984年12月从长江以南大批引进种鸭,之后鸭群发病,并大批死亡。1985年1～2月为发病死亡高潮。经调查梅河口市某养鸭户原有由哈尔滨引进的康贝尔鸭45只,后与南方新引进的50只康贝尔鸭混群,于混群第6天原群鸭出现死亡,经各种药物治疗均不见效果,于第13天原群45只全部死光。某乡政府引进一批南方鸭,由厦门装车时为3700只,一路上大批死亡,到梅河口市时只剩2900只,运到单位后死亡继续增加,直到注射鸭瘟疫苗后才逐渐平息,于注苗后10天停止了死亡,死亡率达50％左右。据不完全统     

Ⅰ型鸭肝炎病毒间接免疫酶染色检测方法的建立

以蔗糖密度梯度离心提纯的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)免疫兔制备兔抗DHV-Ⅰ抗体,建立了检测石蜡组织切片中DHV-Ⅰ抗原的间接免疫酶染色(indirect immunoperoxidase staining,IIS)方法,并对DHV-Ⅰ强毒人工感染死亡或濒死雏鸭的各个组织器官进行了检测。结果表明,IIS与DHV-Ⅰ感染死亡或濒死雏鸭的肝等呈现阳性反应,与鸭瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭的肝以及健康雏鸭的肝呈现阴性反应。感染DHV-Ⅰ死亡或濒死雏鸭的肝、脾、肾、心、胸腺、腔上囊、胰腺、十二指肠、盲肠、空肠、回肠、直肠的免疫组织化学检测呈阳性或强阳性,DHV-Ⅰ抗原主要分布于感染细胞的细胞质。该IIS法具有良好的特异性,可用于DHV-Ⅰ在感染雏鸭组织细胞中的亚细胞定位、DHV-Ⅰ感染雏鸭的实验室诊断、甲醛固定组织的回顾性诊断。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的逆转录套式PCR方法(RT-nested-PCR),采用该方法对DHV-ⅠA66弱毒株和R85952强毒株进行了检测.结果显示,均能扩增到304 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性.该方法第1次扩增的敏感性是100 Pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高106倍.表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎(DVH)的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等.     

鸭瘟病毒TK基因的克隆及其分子特性分析

通过测定动物疫病与人类健康四川省重点实验室构建的鸭瘟病毒(duck plaque virus,DPV)DNA基因文库中重组质粒的DNA序列,得到了该病毒胸苷激酶(TK)基因的ORF.采用PCR扩增出了DPV TK基因并将其克隆到pMD18-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切(BamH Ⅰ Hind Ⅲ)鉴定,并利用生物信息学软件Genscan、ProtScale、SignalP2.0、Scansite、TMpred、Prosite、DNAStar以及在线Predictprotein等分析了TK基因的分子特性.结果显示,DPV TK具有疱疹病毒的典型特征,含有ATP结合结构域和核苷酸结合结构域2个功能结构域,且具有与功能相关的磷酸化位点和氨酰化位点;编码的多肽链中亲水区域大于疏水区域,是一种膜外蛋白.DPV TK基因与禽类疱疹病毒(α-疱疹病毒)的进化关系最近.     

鸭瘟病毒疫苗株在免疫SPF鸭体内的生长动力学检测

为了研究鸭瘟病毒疫苗株在免疫SPF鸭脑、胸腺、脾、肾、肝、法氏囊中的动态分布规律,根据GenBank中鸭瘟病毒的UL6基因设计引物RTF和RTR,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法,建立了特异性强、敏感性高、重复性好的标准曲线。利用建立的标准曲线对采集组织中鸭瘟病毒DNA的拷贝数进行定量。结果显示,免疫后在脑、胸腺、肝、肾、脾、法氏囊均能检测到鸭瘟病毒DNA,且免疫后第1天至第3周,肝、脑、肾中病毒DNA的拷贝数较其他受检组织中鸭瘟病毒DNA的拷贝数高。免疫后至第9周,鸭瘟病毒DNA检出不稳定。试验结束时,除肾、法氏囊外,其他组织中病毒DNA的拷贝数均下降至1×105copies以下。表明鸭瘟病毒疫苗株对SPF鸭组织具有泛嗜性,其主要分布于SPF鸭脑、肝、肾中。