中国大陆株日本血吸虫23kD基因重组抗原的研究─—编码23kD抗原基因克隆的筛选

应用中国大陆株日本血吸虫２３ｋＤ抗原大亲水区多肽和载体ｐＧＥＸ表达蛋白的基因重组抗原（Ｈ－Ｓ．ｊ．２３／ｐＧＥＸ）免疫ＣＢＡ小鼠，制各抗血吸虫２ｓｋＤ抗原的特异性免疫血清，并用该免疫血清作为探针筛选中国大陆株日本血吸虫ｃＤＮＡ文库，从３～４×１０￣４个ｃＤＮＡ噬菌体克隆中共钩取到三个阳性克险，其分子量分别为６００ｂｐｓ、７００ｂｐｓ和１０５０ｂｐｓ，并进一步把７００ｂｐｓ的克隆基因连接到ｐＧＥＭ载体上进行部分双链ＤＮＡ序列分析和ＰｍａｌＰ载体上进行蛋白质表达。     

中国大陆株日本血吸虫23kD基因重组抗原的研究──重组的23kD抗原大亲水区多肽对小鼠的免疫试验

把编码中国大陆株日本血吸虫２３ｋＤ抗原大亲水区多肽的ＤＮＡ片段亚克隆到ｐＧＥＸ载体上进行表达，并用重组抗原和载体ｐＧＥＸ表达蛋白分别免疫了二批ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，结果与未免疫小鼠和载体ｐＧＥＸ表达蛋白免疫小鼠相比，重组抗原免疫小鼠分别获得了５７．８０％～７０．３０％和５２．６３％～６２．９６％的减虫率，证明重组的日本血吸虫２３ｋＤ抗原大亲水区多肽可诱导宿主抗血吸虫攻击感染的部分保护力。     

编码中国大陆株日本血吸虫副肌球蛋白C端蛋白基因的克隆和表达

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）从中国大陆株日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库中扩增到一编码血吸虫副肌球蛋白Ｃ端蛋白的ＤＮＡ克隆，并把该ＤＮＡ进一步亚克隆到ｐＴｒｃＨｉｓＡ载体上进行表达。表达产物的分子量为３３ｋｕ，它和纯化的中国大陆株日本血吸虫成虫副肌球蛋白一样，都能被抗曼氏血吸虫副肌球蛋白的单克隆抗体所识别。说明该重组抗原具有血吸虫副肌球蛋白的抗原性，可被进一步应用于血吸虫病的免疫试验     

猪带绦虫TS61抗原基因的克隆及表达分析

以PCR扩增猪带绦虫TS61抗原基因 ,与载体 pUC18连接后进行测序 ;并构建了该基因的pGEX 1λT原核表达载体 ,制备了其原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS PAGE和免疫印迹分析 ;对该基因的碱基序列及其编码蛋白进行了同源性比较。结果表明 ,猪带绦虫TS61抗原基因含 893对碱基 ,编码含 70个氨基酸残基的多肽 ,分子质量为 8.0ku ,等电点为4.19。在基因库和欧洲分子生物学实验室数据库中均未发现该基因的同源序列。重组质粒在大肠埃希氏菌中表达的融合蛋白分子质量为 3 4ku ,该蛋白抗原能被兔抗猪囊尾蚴超免疫血清所识别。     

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆和分析

为筛选新的有潜在保护性的抗原分子编码基因 ,采用重复感染兔血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 ,将阳性克隆的插入序列进行了PCR扩增和序列分析。结果发现 ,所筛选的阳性克隆中有 2个为日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 (SPI)。序列分析表明 ,它可编码分子质量为 4 .6ku ,等电点为 5 .76的蛋白 ,与GenBank中日本血吸虫SPI基因 (大陆株 )、曼氏血吸虫SPI基因和埃及血吸虫SPI基因编码的氨基酸序列的同源性分别为 98%、6 2 %和 6 2 %。TMpred分析表明 ,该蛋白具有 2个明显的跨膜区即 36～ 5 5和 35 6～ 372位氨基酸。     

日本血吸虫重组抗原Sj GST Paramyosin 和 Sj 23对绵羊的保护性免疫试验

１９９４～１９９５和１９９７年应用日本血吸虫３类候选疫苗分别免疫绵羊，各组的减虫率、粪便虫卵减少率和组织（肝、大肠、小肠）的虫卵减少率分别是：虫体副肌球蛋白（ｎ－ｐａｒａｍｙｏｓｉｎ）组１７．４％～５５．３％，１４．６％～６８．１％和４８．９％～７６．７％；重组副肌球蛋白（ｒ－ｐａｒａｍｙｏｓｉｎ）组４１．４％～４４．２％，１５．９％～２５．１％和４１．１％～４８．０％；Ｓｊ２６谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）组５３．４％～６２．１％，１１．０％～３８．６％和１４．０％～６５．０％；ｒＳｊ２８ＧＳＴ组６１．４％～６８．５％，２２．９％～６０．０％和３９．０％～７６．０％；重组日本血吸虫２３ｋｕ大亲水区表膜蛋白（ｒＳｊ２３）组５１．２％～６６．１％，２１．９％～５８．４％和５４．３％～７６．７％。以ＥＬＩＳＡ检测免疫后的绵羊血清，３类抗原均诱发高水平的特异性ＩｇＧ抗体，表明以上疫苗具有诱发绵羊产生保护性免疫的作用。     

日本血吸虫Sjzfp1基因的克隆表达及其表达产物的免疫效果

以PCR技术从日本血吸虫成虫mRNA反转录制备的cDNA中克隆日本血吸虫锌指蛋白编码基因Sjzfp1以及181～786bp的DNA片段,分别以pGEX-4T和pET-28a(+)为表达载体制备重组抗原rSjzfp1/GST和rSjzfp1-1/His。将重组抗原与206佐剂混合后免疫小鼠,观察免疫预防效果。利用实时荧光定量PCR法检测Sjzfp1在不同发育期虫体中的表达情况。结果显示,获得了日本血吸虫Sjzfp1基因全长序列,其ORF为1017bp,编码338个氨基酸,推导的理论分子质量为38.5ku。生物信息学分析显示Sjzfp1为日本血吸虫环形锌指蛋白或PHD型锌指蛋白。以rSjzfp1/GST和rSjzfp1-1/His免疫小鼠,诱导的减虫率分别为50.43%和17.85%,肝虫卵减少率分别为72.64%和15.96%。实时荧光定量PCR分析表明Sjzfp1基因在各发育期虫体中均有表达,其中在尾蚴和毛蚴中表达量较高,在终末宿主体内各发育期虫体中,以42d成虫表达量最高。结果表明,Sjzfp1基因在抗血吸虫疫苗研究中具有进一步研究的潜力。     

用日本血吸虫重组抗原诊断牛血吸虫病的研究

为寻找可替代虫卵抗原(SEA)用于家畜血吸虫病血清学诊断的重组抗原,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)比较了日本血吸虫23ku膜蛋白大亲水区多肽重组蛋白LHD-Sj23和日本血吸虫SEA检测牛血吸虫病的敏感性和特异性.结果显示,SEA和LHD-Sj23作为诊断抗原对189例血吸虫病牛和92例健康牛的阳性检出率分别为87.8%和90.5%,阳性符合率分别为93.5%和92.4%.两种抗原之间敏感性和特异性均无显著性差异(P0.05).提示,LHD-Sj23重组抗原可替代SEA用于家畜血吸虫病的血清学诊断.     

日本血吸虫重组多表位核酸疫苗的构建与免疫保护效果评估

为构建重组日本血吸虫多表位核酸疫苗,并通过小鼠免疫保护试验比较不同重组多表位疫苗诱导的免疫保护效果,筛选并以PCR方法扩增日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)、谷胱甘肽-S-转移酶(Sj28GST)的抗原表位和23ku膜抗原大亲水区(LHD-Sj23)的编码DNA片段,构建了pCMV-LHD-Sj23-BSj28,pCMV-BGCP-LHD-Sj23,pCMV-BGCP-LHD-Sj23-BSj28三种日本血吸虫多表位核酸疫苗;采用肌肉注射法接种昆明系小鼠;用日本血吸虫尾蚴攻击感染后,剖杀小鼠,计算减虫率。结果显示,3种重组的真核表达质粒在免疫小鼠中分别获得了6.30%,14.76%和64.95%的减虫率。表明该重组多表位核酸疫苗可诱导较高的免疫保护效果,获得的三价核酸疫苗pCMV-BGCP-LHD-Sj23-BSj28具有潜在的应用价值。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39特异性单克隆抗体的制备

为了制备乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位特异性单克隆抗体,将编码乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39的DNA序列进行人工合成,随后插入表达载体pGEX-6p-1的限制性酶切位点BarnH I与Xho I之间,构建了表位肽与GST的融合表达质粒.该表位融合蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合.以化学合成的E39表位多肽为抗原,对融合细胞上清进行间接ELISA筛选.结果,筛选出1株分泌E39表位特异性抗体的杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞分泌抗体能力稳定.经鉴定,该单克隆抗体亚型为IgG2b,轻链类型为k链.结果表明,用表位融合蛋白为抗原可以制备表位特异性单克隆抗体.     

羊脑多头蚴抗原的SDS－PAGE分析

采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）对来自自然感染绵羊脑多头蚴的头节、囊壁可溶性抗原及囊液抗原用垂直平板电泳、连续凝胶系统进行了分析。电泳后以考马斯亮蓝Ｒ－２５０染色。结果：头节抗原共２６条多肽带，其分子量范围１７．５～１４８ｋＤ，其中主带５条，分别为７２、６９、４６、３７和３３ｋＤ；囊壁抗原共２０条多肽带，分子量范围１８～１２６ｋＤ，其中主带４条，分别为６９、４６、２９和１９ｋＤ；囊液抗原共２０条多肽带，分子量范围１８～１６２ｋＤ，其中主带４条，分别为９７、７２、５７和３８ｋＤ。初步阐明了羊脑多头蚴三种不同抗原的部分生化特性，为对该抗原的进一步深入研究奠定了基础。     

日本血吸虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆表达及表达产物的免疫保护效果的评估

为掌握日本血吸虫钙调神经磷酸酶B亚基(CNB)特性并评估其作为候选疫苗分子的潜力,采用PCR方法扩增日本血吸虫CNB基因,构建重组质粒pET-28a(+)-CNB,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用His-Bind亲和层析纯化获得重组蛋白rCNB。Western-blot结果显示,rCNB能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别,具有较好的免疫原性。免疫组织化学分析表明,CNB主要分布在日本血吸虫虫体的睾丸、卵巢等生殖器官中,在表膜中也有少量分布。用重组蛋白rCNB结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,结果 rCNB诱导小鼠产生了27.93%(P0.05)的减虫率和42.93%(P0.01)的肝减卵率。结果表明,日本血吸虫CNB具有一定的免疫保护效果,为深入研究日本血吸虫钙调神经磷酸酶的生物学功能奠定了基础。     

猪囊尾蚴T24基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因,将扩增产物与pGEM-T easy载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting;用所表达的蛋白免疫小鼠,经ELISA检测血清抗体,验证其免疫原性。结果显示。所克隆的T24基因片段长716 bp。含有1个678 bp的开放阅读框,其编码226个氨基酸,与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100％;表达的融合蛋白大小为40 ku,并能被猪囊虫阳性血清识别;免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体,第30 d达到较高水平,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。     

边缘无浆体MSP5重组抗原间接ELISA检测方法的建立

将边缘无浆体MSP5基因在大肠杆菌DH5α中表达,获得45 ku的融合蛋白.Western-blot检测证实该表达蛋白具有良好的生物学活性.以纯化的融合蛋白为抗原,建立了边缘无浆体MSP5的间接ELISA检测方法.该方法对边缘无浆体阴性、阳性血清(各100份)的阳性检出率和阴性符合率分别为100%和98%,与双芽巴贝虫、大巴贝虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、衣原体、血吸虫和羊肝片吸虫的阳性血清无交叉反应,与羊无浆体阳性血清有交叉反应.结果表明,建立的间接EHSA方法具有良好的特异性和敏感性.     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt10a基因的克隆及其在童虫和成虫中mRNA表达量的变化

利用RACE技术从19日龄的日本血吸虫童虫中扩增了1个Wnt家族基因,并对其进行了生物信息学分析。同源性分析表明,该基因为日本血吸虫新基因,完整开放阅读框(ORF)长1896 bp,编码631个氨基酸,理论分子质量为73.3 ku。该基因编码的氨基酸序列具有Wnt家族蛋白的典型特征,与人、鼠Wnt10a的氨基酸序列同源性均为26%,推测为血吸虫的Wnt10a基因,命名为Sjwnt10a(Gen BanK登录号DQ643829)。利用实时荧光定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况,结果显示该基因在19日龄的日本血吸虫童虫中表达量最高,在14日龄童虫和44日龄雄虫中也有表达,但分别仅为19日龄童虫表达量的8.8%和5.0%,而在31日龄成虫和44日龄雌虫中没有检测到该基因。结果提示,童虫差异表达的Sjwnt10a基因可能对童虫的生长、发育至关重要。     

马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。     

柔嫩艾美球虫扬州株SO7抗原基因表达条件的研究

通过RT-PCR扩增柔嫩艾美球虫YZ株折光体SO7抗原基因,并进行克隆和测序。将不含信号肽编码区片段的SO7基因克隆入表达载体pGEX-6p-1谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游,构建表达质粒pGEX-6p-1-SO7,转化宿主菌BL21,获得重组菌。通过建立生长曲线,对诱导条件的摸索,根据SDS-PAGE确定融合蛋白的最佳表达条件。通过融合蛋白切胶免疫小鼠制备超免疫血清,经间接ELISA检测其与E.tenella子孢子抗原反应的特异性。结果显示,诱导时机和诱导时间是影响表达的主要因素,诱导温度、IPTG浓度次之;诱导时机以3 h为最佳,诱导时间以4.5 h为最佳;诱导温度以37℃最佳,0.008~1.000mmol/L的IPTG对表达量的影响不大。在优化的表达条件下,表达产物主要以包涵体存在,表达量占菌体总蛋白的37.5%。间接ELISA结果表明融合蛋白具有一定的免疫原性,保留了天然蛋白的部分抗原性。     

金黄色葡萄球菌疫苗候选分子StbA主要抗原表位区的表达及重组蛋白抗血清的制备

通过生物信息学软件分析金黄色葡萄球菌转铁蛋白结合蛋白(StbA)的主要抗原表位区,PCR扩增StbA主要抗原表位区的编码序列;将该序列插入表达载体pGEX-4T-1中,测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌能表达出分子质量约为54 000u的重组融合蛋白。表达产物经亲和层析纯化后可获得较高纯度的目的蛋白。Western-blot检测证实该重组蛋白能与乳腺炎患病奶牛恢复期血清发生阳性反应。ELISA结果显示,重组蛋白免疫新西兰大白兔能产生高效价的抗血清,提示StbA主要抗原表位区能刺激机体产生强大的免疫应答,StbA是一个有潜力的保护性抗原候选分子。     

以包涵体形式表达的猪带绦虫六钩蚴重组抗原的复性与纯化

应用比浊法、可溶性蛋白百分比、夹心ＥＬＩＳＡ及变性与非变性ＳＤＳＰＡＧＥ等方法来评价猪带绦虫六钩蚴重组抗原的不同复性条件。透析法复性,透析液为含２ｍｏｌ／Ｌ尿素,１６０μｍｏｌ／ＬＰＥＧ４０００,１．０ｍｍｏｌ／Ｌ０．１ｍｍｏｌ／ＬＧＳＨＧＳＳＧ的ｐＨ９．０的ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液,蛋白浓度为２～５ｍｇ／ｍＬ,以静置缓慢透析为佳,上述条件任意缺一或快速透析,则免疫活性下降,二聚体、多聚体明显增加;稀释法复性,复性液为上述透析液,蛋白浓度０．１ｍｇ／ｍＬ,以分步缓慢稀释为佳。透析法复性与稀释法复性最佳条件的实验结果无显著差别。透析法复性的重组蛋白进行Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ分子筛凝胶层析,出现２个主峰,收集有免疫活性的第１峰进行ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析,用含５０ｇ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ９．０的ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液洗脱,亦出现２个主峰,收集有免疫活性的第１峰。ＳＤＳＰＡＧＥ显示该峰为单一蛋白条带,蛋白纯度大于９０％。夹心ＥＬＩＳＡ检测免疫活性,每１ｍｇ蛋白的效价大于６×１０５。     

日本血吸虫重组蛋白LHD-Sj23-GST诱导的细胞免疫应答和免疫保护效果

为探讨日本血吸虫重组蛋白LHD-Sj23-GST与3种不同类型佐剂(弗氏佐剂、ISA 206佐剂、ISA70M佐剂)配伍后免疫小鼠诱导的细胞免疫应答及免疫保护效果,应用流式细胞术检测并比较该重组蛋白配伍3种佐剂3次免疫后小鼠脾细胞中的CD4+、CD8+T细胞及细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10水平;3次免疫后小鼠人工攻击感染日本血吸虫尾蚴,6周后经肝门静脉灌注冲虫,计数各组平均虫体数并计算减虫率。与PBS对照组相比,LHD-Sj23-GST/FA和LHD-Sj23-GST/70M免疫组的CD4+T细胞显著升高(P<0.05),LHD-Sj23-GST/206免疫组未呈现明显变化;3种不同佐剂配伍LHD-Sj23-GST免疫组CD8+T细胞水平均显著降低(P<0.05);与PBS对照组相比,免疫组的IFN-γ及IL-10水平升高,而IL-4水平降低。LHD-Sj23-GST/FA、LHD-Sj23-GST/206和LHD-Sj23-GST/70M免疫组与PBS对照组相比,分别获得65.52%、51.72%和51.72%的减虫率;而相较于各自的佐剂对照组,则分别获得58.76%,26.31%,54.28%的减虫率。结果表明,用重组蛋白LHD-Sj23-GST配伍3种不同类型佐剂免疫小鼠,均刺激产生了偏向Th1型的细胞免疫应答,且都对小鼠诱导了较高的免疫保护作用。