应用PPA-ELISA诊断猪瘟

酶联葡萄球菌A蛋白(PPA)作为一种广谱的免疫酶试剂,用于家畜多种传染病和寄生虫病的诊断已收到良好的效果。我们试用PPA-ELISA进行猪瘟诊断,结果令人满意。该试验尚未见报道。 (一)材料 1.固相载体:平底40孔聚苯乙烯微量培养板,系上海塑料三厂产品,用前需经鞣酸处理。 2.抗原:猪瘟石门系强毒系中国兽药监察所提供。 3.猪抗猪瘟高免血清:用猪瘟石门系血清毒制成结晶紫灭活苗作基础免疫健康猪2     

用抗体致敏SPA菌体浓缩新城疫病毒方法的建立

将金黄色葡萄球菌与灭活的猪抗新城疫病毒(NDV)抗血清混合,37℃感作致敏30min,将致敏的金黄色葡萄球菌加入NDV污染材料洗脱液中,37℃水浴30min,离心洗涤并悬浮菌体于PBS中,取适量用于电镜观察或RTPCR。结果显示,电镜下观察可见NDV吸附到金黄色葡萄球菌表面;经RTPCR对吸附NDV的菌体进行扩增后可见到特异性扩增带。通过条件优化,建立了NDV浓缩方法。用HA效价为29的NDVF48E9毒株尿囊液1∶800、1∶1600和1∶3200稀释液分别喷洒树叶及谷物,采用上述方法浓缩病毒,并经RTPCR检测。结果表明,致敏的金黄色葡萄球菌能够浓缩病毒,提高RTPCR检测的敏感性。     

应用酶联免疫吸附试验诊断弓形虫病

1984～1986年,本课题协作组在广西、北京、福建、安徽、黑龙江、浙江等省市的6个单位进行了弓形虫病酶联免疫吸附试验诊断方法的研究,建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)。 葡萄球菌A蛋白—酶联免疫吸附试验(SPA—ELISA)固相免疫酶底物珠试验(DASS),玻片虫体过氧化物酶联免疫吸附试验(TSHE),玻片虫体—葡萄球菌A蛋白酶联吸附试验(TSSH)5种酶联试验方法,现汇总报告如下。     

应用SPA-固相免疫电镜法检测口疮病毒

我们在进行骆驼传染性口疮病原分离鉴定研究中,采用SPA—固相免疫电镜法检测口疮病毒,获得较好效果。 (一)材料和方法 1.抗原 (1)骆驼传染性口疮病毒:取自人工感染发病驼痂块,按常规方法作1:10(W/V)稀释,—20℃冻结保存,使用前水浴融化,4000rpm离心30分钟,取上清备用。     

动物病毒病的免疫电镜诊断方法

应用电子显微镜(电镜)技术进行病毒病的诊断,是当今病毒学诊断方法中不可缺少的手段,仅管起用时间不长,但是随着电镜制样方法的改进,尤其免疫电镜技术的应用,已越来越引起人们的注意。由于病毒体积很小,超过了光学显微镜分辨率的极限范围,所以要想直接观察到病毒粒子,只有借助于高     

一株奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的研究

本研究旨在分离鉴定奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌噬菌体,并研究其生物学特性。利用双层琼脂噬菌斑法从生活污水中分离金黄色葡萄球菌噬菌体;通过核酸酶处理分析核酸类型;采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小;同时测定其最佳感染复数、一步生长曲线和裂解谱。结果显示,本研究分离到1株烈性金黄色葡萄球菌dsDNA噬菌体,命名为噬菌体SAGD1。该噬菌体头部呈二十面体,直径约98nm,有一带伸缩尾鞘的长尾,大小约14nm×200nm,属于肌尾噬菌体科。该噬菌体的最佳感染复数为0.01;感染宿主菌潜伏期约20min,裂解期约30min,裂解量为80。且该噬菌体能裂解1株表皮葡萄球菌及35株金黄色葡萄球菌。结果表明,本研究分离的烈性噬菌体具有金黄色葡萄球菌生物抑菌剂的应用潜力。     

应用IgG-SPA菌免疫法制备兔抗豚鼠IgG血清

第二抗体是免疫学研究及临床检验工作中经常应用的重要试剂之一,但目前制备第二抗体,仍多用常规的佐剂免疫法进行,既复杂又费时费力。笔者依据金黄色葡萄球菌细胞壁上的A蛋白,能与豚鼠IgG的Fc段结合的特性,将含A蛋白的葡萄球菌(SPA菌)与豚鼠全血清作用,制成IgG-SPA菌液,作为免疫原,给兔静脉注射,制备兔抗豚鼠的IgG血清,获得了较满意的结果。 (一)材料 1.菌种:含A蛋白金黄色葡萄球菌Cowan I,菌种编号26111,购自卫生部药品生物制品检定所。     

牛源金黄色葡萄球菌FnBPAA基因与D基因表达产物的免疫原性比较

为评价金黄色葡萄球菌黏附素蛋白FnBPA A和FnBPA D基因表达产物的免疫原性,分别用纯化的重组原核表达蛋白FnBPA A和FnBPA D免疫新西兰白兔,通过ELISA方法检测免疫家兔血清的抗体效价,用双抗体夹心法检测细胞因子的表达水平及进行全血调理吞噬试验。结果显示,在三免后第7天抗体水平分别可达1∶12 800(FnBPA A)、1∶25 600(FnBPA D),并且FnBPA A免疫组的全血杀菌能力优于FnBPA D免疫组;同时,两者均能提高家兔体内IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的表达水平,且FnBPA D组显著高于FnBPA A组(P0.05)。结果表明,FnBPA D基因较FnBPA A基因更适合作为奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌基因工程亚单位疫苗的候选基因。     

金黄色葡萄球菌生物被膜形成的鉴定及白果外种皮多糖对其抑制作用的研究

为体外鉴定金黄色葡萄球菌生物被膜的形成,研究新鲜白果外种皮多糖(GBSP)对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用。通过刚果红鉴定、结晶紫定量检测考察金黄色葡萄球菌在体外建立生物被膜,并用微孔平板法检测多糖对金黄色葡萄球菌早期和成熟期生物被膜的最小抑膜浓度(MBIC)和最小杀膜浓度(MBBC)。结果显示,金黄色葡萄球菌可以产生多糖黏附素(PIA);金黄色葡萄球菌生物被膜随着培养时间的延长,生物被膜逐渐成熟,在12 h左右开始黏附载体表面,24 h之后达到成熟期;新鲜GBSP对金黄色葡萄球菌早期生物被膜的MBIC和MBBC是100 mg/mL。表明,新鲜GBSP对金黄色葡萄球菌生物被膜具有良好的体外抑制作用,为新鲜GBSP开发为抗菌制剂奠定了理论基础。     

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染对BMEC炎性因子mRNA表达的影响

为了探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)在不同时间点对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)相关炎性因子转录水平的调节作用。本试验通过体外培养BMECs并对其进行免疫细胞化学方法鉴定。选取纯化后的原代BMECs,分别加入活菌比(MOI)为100∶1的最佳浓度的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌对细胞进行感染,分别在感染后第0、3、6、9、12小时采样,采用qRT-PCR法检测IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达情况。结果显示,在添加1×102CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第6小时IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。在添加1×101CFU/m L大肠杆菌作用至第6小时,IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L大肠杆菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L大肠杆菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。本试验结果表明,使用最佳浓度金黄色葡萄球菌或大肠杆菌作用于BMECs时,在最佳感染时间点可显著上调IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达量。IL1R1、IL-1β及TNF-αmRNA表达量在临床上可作为创伤后炎症反应的敏感指标,能评价炎症反应的严重程度,对乳腺炎的病程诊断具有重要意义。本试验结果为进一步研究细菌感染引起乳腺炎的致病机理提供了理论依据。     

阿莫西林杀灭金黄色葡萄球菌的药代动力学和药效动力学关系

建立了体外药代动力学和药效动力学(PK-PD)模型,测定了阿莫西林杀灭金黄色葡萄球菌的药代动力学参数和药效动力学参数,并研究了它们之间的关系.结果表明,T＞最低抑菌浓度(MIC)是衡量阿莫西林药效的关键指标,当阿莫西林浓度超过MIC时,初始浓度0.4～3.2μg/mL对杀灭金黄色葡萄球菌的药效没有影响.在消除半衰期为2 h的模型内,T＞MIC在7.40 h以上时阿莫西林对金黄色葡萄球菌有较好的杀灭效果;在消除半衰期为5.5 h的模型内,T＞MIC在11.76 h以上时阿莫西林对金黄色葡萄球菌有较好的杀灭效果.     

奶牛乳腺炎葡萄球菌刃天青微量板快速诊断方法的建立与应用

将葡萄球菌选择培养基mBP分装96孔微量板,接种细菌纯培养、感染模拟奶样或乳腺炎阳性奶样,培养2h加入0.4g/L刃天青指示剂,继续培养至12h,根据培养基颜色变化判断细菌是否生长。细菌纯培养结果显示,此刃天青微量板能显示金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌、产色葡萄球菌、模仿葡萄球菌和溶血葡萄球菌生长,不能显示链球菌等非葡萄球菌生长,培养基变色时间与细菌浓度和培养时间呈正相关。模拟奶样的培养结果显示,刃天青微量板检测奶样葡萄球菌的灵敏度为1×103 CFU/mL,能在12h内获得明确的诊断结果,且能反映奶牛乳腺的葡萄球菌感染强度。乳腺炎阳性奶样的培养结果显示,刃天青微量板诊断葡萄球菌阳性奶样的符合率为98.3%(n=60),诊断葡萄球菌阴性奶样的符合率为95.0%(n=40)。这些研究结果表明,本研究建立的刃天青微量板能取代常规方法用于奶样葡萄球菌的快速诊断。     

鸡源金黄色葡萄球菌的血清型分型

金黄色葡萄球菌是引起鸡葡萄球菌病的病原菌,研究鸡源金黄色葡萄球菌的血清型,对流行病学调查、菌苗的制备和疫病防制有重要意义。自1939年Cowan氏首创葡萄球菌血清学分型研究工作以来,很多学者对人源金黄色葡萄球菌进行过血清型分型,但鸡源金黄色葡萄球菌的血清型分型,研究甚少。近年来,我国鸡葡萄球菌病比较严重,我们结合生产需要,从葡萄球菌病死亡鸡、被羽、鸡粪中分离出来的金黄色葡萄球菌,按照Oe-ding方法进行了血清学分型。(一)材料与方法1.菌株来源:①标准菌株:由卫生部药品生物制品检定所赠给的金黄色葡萄球菌标准株:17AF22、2253、S365、1503、2095、3189、3647。②     

泻痢宁胶囊体外抑菌试验和毒性试验

(一)材料和方法 1.抑菌试验: (1)菌种:由军兽医大学微生物教研室提供,有大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、肠炎杆菌、鼠伤寒杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、腺疫链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌等9种细菌。 (2)药品:试验药品有泻痢宁胶囊(吉林省白城制药厂生产),对照药品有黄连素、痢特灵、链霉素、新诺明、氯霉素等。各药取1kg体重所需剂量用注射用水稀释至10毫升备用,对难溶药物研细后溶解,用前振荡混匀。     

应用固相补体结合反应检测家畜伊氏锥虫病的试验研究

固相补体结合反应在兽医临床上应用尚少,应用此法检测家畜锥虫病尚未见报道。此法是将补反中的溶血系融合在固相琼脂糖中,根据特异性抗原抗体结合时消耗补体的原理,观察溶血系在反应孔周围发生溶血程度,再依据溶血圈的大小判知被检血清中有无抗体,从而做出诊断。     

金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖偶联抗原的制备及免疫原性分析

为建立金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)纯化与偶联技术方法,获得具有免疫原性的CP5偶联抗原,采用高压破碎菌体的方法释放荚膜多糖,酶处理去除核酸和蛋白质,通过离子交换层析进一步纯化,得到纯化的CP5,并对其纯度和反应原性进行检测;采用己二酸二酰肼(ADH)间桥法制备CP5-牛血清白蛋白(CP5-BSA)偶联抗原,加佐剂免疫小鼠,进行抗体水平测定。结果表明,纯化的CP5纯度为675.1g/kg,经用免疫琼脂双扩散试验检测,纯化多糖仅与同型菌株抗血清发生沉淀反应,偶联抗原CP5-BSA可以刺激小鼠产生CP5免疫应答。此研究结果为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的研制提供了试验依据。     

金黄色葡萄球菌凝聚因子A区基因的克隆表达及表达产物的免疫学特性

采用PCR技术对引起乳牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌凝聚因子(ClfA)A区基因进行了扩增和克隆测序,并对测序结果用DNAStar软件进行了抗原表位分析,成功构建了原核表达质粒pET-32a-ClfA A.将其转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,证实目的蛋白以可溶形式存在.用His·Bind柱对其纯化后获得了纯度较高的蛋白.纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价的抗血清,通过ELISA、试管凝集试验、吞噬调理试验、抗体抗金黄色葡萄球菌黏附能力检测等对表达产物及制备的超免疫血清进行了检测.试验证明目的蛋白具有黏附活性,自制的超免疫血清具有抗金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的作用以及吞噬调理作用,所表达的蛋白为ClfA A蛋白.     

金黄色葡萄球菌Fc段受体结合蛋白A基因的克隆与原核表达

为研制葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)的相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从金黄色葡萄球菌基因组中扩增出了876bp的细胞壁结合蛋白SPA基因,该基因编码292个氨基酸,包含了E、D、A、B、C 5个IgG结合结构域。构建了原核表达载体pET28a(+)-SPA,经IPTG诱导,表达出分子质量约35.0ku的SPA蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPA蛋白,Western-blot分析表明纯化的SPA蛋白具有生物学活性。     

酶标免疫电镜技术在牛白血病病毒形态学研究中的应用

迄今,国内外对于牛白血病病毒的酶标免疫电镜观察尚无报道。我们首先将该项技术应用到对牛白血病病毒的形态学研究上,从而进一步明确了此病毒在宿主细胞内的分布、抗原定位以及该病毒粒子的形态特征。 (一)材料 1.牛白血病病毒感染的羊胎肺细胞(FLL)初期培养物;2.羊抗牛白血病病毒血清。以上两种原材料均由牛白血病防制课题组提供。3.健康羊胎肺细胞培养物,由魏仁山先生提供。4.冻干酶联葡萄球菌A蛋白纯品,由上海生物制品研究所购入。     

免疫金银技术

FaulR等(1971)将胶体金标记引入免疫化学,创建了免疫金染色法(Immun-goldstaining,IGS)。Geogh-egan等(1978)首先将胶体金染色法用于光镜水平的免疫标记。虽然高浓度的IGS试剂可使细胞染成红色,但由于金粒子太小,光镜下难以辨认,且用量大、价格昂贵,既不经济,也不敏感。因此,Holgate等(1983)将IGS改进发展为免疫金银染色法(Immun-gold-slwer staininy,IGSS),大大提高了检测的敏感性,使免疫细胞化学技术有了新的飞跃。与其它免疫标记技术相比,此法不影响二抗或葡萄球菌蛋白A与一抗的结合活性;而且灵敏度高(比PAP法至少敏感200倍),操作简便安全,所染标本不退色、易保存,可以在一般实验室推广使用,是目前免疫组化最敏感的方法之一。