分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体杂交瘤株的建立

本试验以DEAE纤维柱层析法从感染小鼠血液中分离得纯净锥虫,再通过超声乳化,制备锥虫可溶性抗原,用其免疫BALB/c小鼠,再以此BALB/c小鼠脾细胞与SP_2/o骨髓瘤细胞融合,采用Dot-ELISA和间接ELISA法筛选出7株分泌针对伊氏锥虫的单克隆抗体的杂交瘤株(IH_(10)、AE_7、EB_6、BE_5、AG_(11)、BA_5、GB_6),实验结果表明,间接ELISA和Dot-ELISA符合率良好。分泌的7种克隆抗体有5株属于IgG_1,2株属于IgG_(2a);用阴性血清封闭试验及交互抑制试验证实7株单抗都是针对伊氏锥虫的,并证明是针对不同决定簇的。     

布氏锥虫伊氏亚种体外培养的研究——布氏锥虫伊氏亚种的纯净培养

用无细胞培养系统培养我国3株水牛源布氏锥虫伊氏亚种取得成功。从开始培养的第7天起,向虫数已很少且不增殖的培养物中逐日补种少量滋养层细胞系统培养的培养日龄相同的同株锥虫,于10～17天间逐步建立了适应于无细胞系统的锥虫群体。整个适应过程可分为4个阶段——一过性生长期、生长停滞期、初步适应期和完全适应期。至今已连续培养9个月,虫密度一般保持在1×10~6/ml左右,最高可达1.9×10~6/ml。锥虫在培养物内有规律地呈现岛屿状密集分布。长期培养的锥虫仍保持单一细长形态,具表面被膜、对小白鼠有致病力。对已适应于无细胞系统的锥虫,成功地进行了克隆、冻存、复苏后可直接继续培养。实验表明,培养液中2-ME和马血清的适宜浓度分别为0.3mmol和20％,添加0.1mmol次黄嘌呤可使虫密度增加约1倍。用烛罐可取代CO_2-培养箱。基础培养基贮存于-20℃,至少可使用76天。     

伊氏锥虫动基体DNA微环的克隆

把伊氏锥虫云南株动基体DNA微环重组于puc19质粒载体,转化入大肠杆菌JM103菌株,获得KDNA全微环克隆。用α-~(32)P-dATP经缺口翻译标记的重组质粒(PTK)能与伊氏锥虫及其KDNA杂交,而不与核DNA杂交。该质粒探针具有高度的敏感性,能检测出10pg的KDNA和100个锥虫体,是快速鉴定伊氏锥虫的理想工具。     

伊氏锥虫灭活苗对役牛的免疫效果观察

用从湖北当地水牛分离的伊氏锥虫制备伊氏锥虫灭活苗,在湖北省当阳市以10 mL/头剂量免疫接种役牛12 500头.免疫后1个月,随机抽取其中15头免疫牛,每头经皮下攻虫1×104条,仅有1头牛出现虫血症,保护率为99.33%(14/15).其余免疫牛中有22头出现虫血症,保护率为99.82%;免疫牛血清间接血凝效价为18～11280.药物预防组的12 407头牛中,有763头出现临床症状和虫血症,其中12头死亡,保护率为93.87%.     

布氏锥虫伊氏亚种的体外克隆

应用改良的Baltz无细胞培养系统,参照Hirumi以饲养层培养 系统克隆锥虫的方法,建立了布氏锥虫伊氏亚种的体外克隆方法。对3个 虫株进行克隆,被检虫悬液液滴42.5％～47.5％只含1条锥虫;克隆培养的成功率JG株为67.7％,YN株为78.％,CVCC614株为70.6％。     

伊氏锥虫PFR2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为了探究伊氏锥虫副鞭毛杆蛋白2(paraflagellar rod protein 2,PFR2)的分子特征和免疫特征,利用PCR扩增伊氏锥虫PFR2基因,将扩增产物插入p QE-80L载体,经原核表达后,将纯化后的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,利用Western-blot鉴定反应原性。结果表明,PFR2基因大小为1 803 bp,编码含601个氨基酸残基的蛋白质,SDS-PAGE电泳显示该蛋白大小约为66 ku,主要以包涵体的形式表达。用间接ELISA方法检测小鼠抗PFR2多克隆抗体的效价为1∶25 600;Western-blot检测显示重组PFR2蛋白具有较好的反应原性。本研究为进一步研究伊氏锥虫PFR2蛋白的功能奠定了基础。     

以单克隆抗体检测伊氏锥虫可溶性抗原的研究

通过单抗和多抗的不同组合,以夹心ELISA法检测伊氏锥虫可溶性抗原,发现混合单抗法敏感性最高,可检出最低抗原浓度达0.04～0.02μg/ml,比通过免疫动物制得的多克隆高免血清提高1～2个稀释度。     

布氏锥虫伊氏亚种体外药敏试验

应用布氏锥虫伊氏亚种(Trypanosoma brucei evansi,T.b.e)体外药敏试验系统检查了国内6个T.b.e虫株和国外布氏锥虫指名亚种(T.b.b)对苏拉灭(Suramin)、贝尼尔(Berenil)、安锥赛(Antrycide)、咪唑苯脲(Imidocard)和硫胂聚氰胺(Cymelarsan)等5种抗锥虫药的敏感性。结果表明,该系统能准确测定不同虫株对各种药物的敏感性,与小鼠治疗试验结果基本相符,发现了国内抗贝尼尔和苏拉灭的T.b.e虫株。     

锥虫不同分离株克隆及其等电聚焦分析

将两个伊氏锥虫及一个马媾疫锥虫的不同分离株分别接种用环磷 酰胺处理的小鼠,获得五个克隆,用等电聚焦比较其蛋白质差异。结果表 明,三个分离株之间有明显区别;马媾疫锥虫显著不同于伊氏锥虫;分离株 不同克隆间区别较小,其中广东水牛株两克隆间带型相同,安徽水牛株两克隆间带型略有区别。证明伊氏锥虫克隆间变异较小,锥虫不同分离株间变异较大,马媾疫锥虫与伊氏锥虫之间变异最大。     

伊氏锥虫抗原变异型及其优势代表变异体的分离鉴定

以连续克隆分离的方法,从1株水牛伊氏锥虫中分离到40个克隆群体,从中分离鉴定出18个抗原变异型.经间接免疫荧光试验检测,发现其中2个抗原变异型(即HbTatl.18和HbTatl.15)分别能与约80%和60%克隆群体的血清发生较强的阳性反应,初步确定这2个抗原变异型为该虫株的优势代表变异体.这为伊氏锥虫免疫预防、免疫诊断、分子诊断以及遗传进化等的研究奠定了良好的基础.     

中国家畜伊氏锥虫主要流行株对安锥赛的抗药性检测

用生长繁殖抑制试验测定伊氏锥虫AHB、GDB1、GDB2、GDH、GXM、HBM、HNB、JSB1、JSB2、XJCA、YNB和ZJB株的IC50值分别是0.016400、0.066940、0.022500、0.053500、0.007390、0.008436、0.037600、0.016200、0.05906、0.001511和0.012460 μg/mL.为检验生长繁殖抑制试验的准确性,用XJCA、HBM、ZJS和JSB1株腹腔接种小白鼠,用安锥赛5.0 mg/kg剂量治疗,治愈率分别为100%、100%、90%和60%.表明生长繁殖抑制试验结果与小白鼠治疗试验结果呈正相关,同时表明XJCA、GXM和HBM株对安锥赛没有抗药性,而ZJB、JSB1、AHB、GDB2、YNB、HNB、GDH、JSB2和GDB1株对安锥赛己有不同程度的抗药性,提示这些虫株分布地区治疗家畜伊氏锥虫病应适当增加安锥赛的剂量.     

家畜伊氏锥虫多因素致弱苗免疫试验观察

用伊氏锥虫多因素致弱苗免疫小白鼠３０只，在免疫后３０，４５，６０ｄ各取１０只小白鼠攻虫，保护率依次为９／１０，８／１０，６／１０；３次空白对照小白鼠均于注锥虫后４～７ｄ死亡。免疫豚鼠３０只，在免疫后３０，６０，９０ｄ各取１０只豚鼠攻虫，保护率依次为１０／１０，９／１０，８／１０；３次空白对照豚鼠均于注锥虫后１７～２３ｄ死亡。免疫马９匹，在免疫后３０，６０，９０ｄ各取３匹马攻虫，均获３／３保护；继续观察至１１个月，免疫后攻虫马均正常，镜检阴性，动物试验阴性；３次空白对照马均在注锥虫后４５～５０ｄ死亡。     

应用超薄层平板聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分析伊氏锥虫可溶性抗原的初步研究

将广西骡株伊氏锥虫通过生物增殖，ＤＥＡＥ纯化，反复冻融，１００００ｒ／ｍｉｎ离心３０分钟，得到伊氏锥虫可溶性抗原（ＳＡｇ），在１０℃，１５００Ｖ，３ＯｍＡ，２５Ｗ的条件下进行起薄层聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，考马斯亮蓝Ｒ２５０染色，结果出现１８条蛋白带。各自的等电点为４．６２、４．８２、４．９６、５．０３、５．１０、５．１３、５．２２、５．３２、５．４４、５．５１、５．６５、５．７２、５．９６、６．０２、６．０９、６．３０、６．５６、７．３。各条蛋白带的绝对含量为０．０２、０．０４、０．０２、０．０４、０．７１、０．０２、０．８０、０．４２、６．００、１０．５４、９．９７、７．９２、１１．８４、１５．１８、９．７８、３．４３、３．０６、３．１８μｇ。等电点在５．４４～６．０９之间的蛋白分子是伊氏锥虫可溶性抗原的主体。     

分泌抗布氏锥虫群共同抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用DEAE-纤维素分离的布氏锥虫伊氏亚种JG克隆株虫体按Segura 氏法制备抗原,常规免疫BALB/c鼠、融合、筛选和克隆。筛选时除使用免疫抗原外,还使用按同法制备的我国不同地区分离的3株布氏锥虫伊氏亚种(JX、ZJ、GY株),1个布氏锥虫马媾疫亚种虫株和培养的1株布氏锥虫指名亚种发育前期型虫体的抗原,以及泰氏锥虫和弓形虫抗原。共获得8个杂交瘤细胞株(4A_(11)、2D_6、5C_8、2E_3、1H_8、1C_9、1F_(11)、4F_6。它们分泌的单克隆抗体与泰氏锥虫、弓形虫抗原均无反应。4A_(11)、2D_6在ELISA和间接免疫荧光试验中只与免疫克隆株抗原反应。其余6株在ELISA中不仅与免疫株抗原反应,而且与其他锥虫虫株抗原呈明显交叉反应,免疫荧光试验则全部阴性。在ID试验中,1C_9、1F_(11)腹水与上述6种抗原呈现明显沉淀线,另6株则均无反应。4A_(11)和2D_6是针对伊氏锥虫群JG克隆株特异抗原,而5C_8、2E_3、1H_8、1C_9、1F_(11)、4F_6则是抗布氏锥虫群共同抗原。     

马(骡)体内伊氏锥虫循环抗原与抗体的相互关系研究

本文利用抗伊氏锥虫表膜抗原的单克隆抗体ELISA双抗体夹心法,对健康、人工接虫及先用伊氏锥虫弱毒株免疫后用强毒株攻击马(骡)血清的循环抗原(CAg)进行了追踪检测,同时用常规ELISA法检测了相应的循环抗体(CAb),结果为:CAg与CAb不全呈平行关系;部分免疫马(骡)首次攻虫前CAg即可呈现阳性,CAb为阴性;免疫马(骡)攻虫后大多经1～3个CAg高峰而后健活,CAg逐渐转阴,CAb则上升较慢,上升后则一直维持在较高水平:人工接虫马(骡)接虫后经1～2个CAg高峰而死,濒死前4/5动物CAg呈现阳性,而CAb在濒死前只有1/5呈现阳性;人工接虫马(骡)的CAg水平高于免疫马(骡),二次攻虫后的CAg水平高于首次。     

伊氏锥虫同工酶的研究

本文对我国5株伊氏锥虫的5种同工酶进行了初步研究。应用琼脂糖凝胶电泳技术检测了5株伊氏锥虫的苹果酸脱氢酶(MDH)、L-苹果酸辅酶Ⅱ氧化还原酶(ME)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、葡萄糖磷酸异构酶(GPI)和已糖激酶(HK)。5株伊氏锥虫的MDHME同工酶谱均相同,而G6PD、GPI和HK的同工酶谱显示出差别。分析表明,尽管某些同工酶谱存在着差异,但从总体水平分析,这些伊氏锥虫同工酶谱仍具有较高的相同性,属同源种群。     

山羊成骨细胞的体外培养和鉴定

采用初生山羊羔股骨骨膜,通过植块培养法、完全消化法和半消化植块法分离、培养成骨细胞。结果表明,植块培养法、完全消化法和半消化植块培养法的贴壁时间分别为4、24、4 h;培养4 d时的细胞数量分别为少量细胞、少量细胞、大量细胞,细胞汇合时间分别为21、19、10 d。传代后第7 d即可汇合,第14 d出现矿化结节,茜素红染色呈橘红色,Von Kossa染色呈黑色;姬姆萨和HE染色后可见体外培养的细胞呈三角形、多角形,胞质丰富,胞核卵圆形,单核,有1~3 个核仁;碱性磷酸酶染色后胞质呈黑色颗粒或块状沉淀;扫描电镜观察胞突发达,伸出的突起与临近细胞的突起相连。体外培养传至15代时细胞的生物学性状未发生变化。试验结果显示,半消化植块培养周期短,细胞损害小,有利于细胞贴壁,是一种可行的骨组织工程研究方法。     

伊氏锥虫诱导鼠免疫抑制试验的研究

锥虫免疫抑制研究最早是由Goodwin于1970年报道的,他利用绵羊红细胞作为抗原来检查兔、鼠感染布氏锥虫后所产生的免疫抑制,以后其它学者也相继在刚果锥虫和活跃锥虫上进行过研究,并对其机制也进行了探讨。到目前还未见到国内外关于伊氏锥虫免疫抑制的研究报道,因此本试验旨在初步探索是否伊氏锥虫感染亦对机体产生免疫抑制,锥虫感染时间与免疫抑制有何关系以及抗锥虫药物治疗后又对其免疫有何影响?从而为伊氏锥虫研究以及为提高诊断和疫苗效果提供科学依据。     

吉氏巴贝虫的体外培养试验

采用微气静相培养技术,对吉氏巴贝虫体外培养条件进行了比较,在RPMI 1640中补充体积分数(下40%犊牛血清,在5%O2、5%CO2、90%N2高湿度环境中进行通气培养,每24 h更换1次培养液,每7 d补充一部分红细胞,获得了较高的染虫率.以体外培养结合SCID小鼠腹腔注射交替的方式进行传代培养,每进行一轮体外培养,可使红细胞染虫率升高,连续培养时间延长.目前的试验中体外培养时间可维持48 d,长期培养的吉氏巴贝虫仍具有感染性.     

伊氏锥虫 布氏锥虫和马媾疫锥虫对锥46的药敏试验

在我国,伊氏锥虫病流行 极广,达二十多个省区,对畜牧业生产危害极大。长期以来,伊氏锥虫病的治疗主要依赖为数甚少的几种药物,导致抗药虫株的产生,从而给该病的防治带来新的困难(沈杰等,1991;方元等,1992),急待高效新药产生。为了解决这一问题,上海家畜寄生虫病研究所与上海医药工业研究院合作,成功地合成、筛选了一种抗锥虫新药——雄46(T46)。确定伊氏锥虫对其的药敏性,为锥46的临床应用奠定合理的用药理论基础是十分必要的。本试验通过体内(小鼠治疗)和体外(人工培养)的方法检测了伊氏锥虫布氏锥虫和马媾疫锥虫对锥46的敏感性。