猪流感病毒NS1蛋白关键氨基酸位点突变对蛋白定位及细胞因子水平的影响

为探析猪流感病毒NS1蛋白中影响细胞定位和拮抗干扰素表达的关键氨基酸位点,本研究利用点突变技术扩增A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分离株NS1突变基因,并构建重组表达质粒pCAGGS-NS1及突变体pCAGGS-NS1_(S42P)、pCAGGS-NS1D_(92E)、pCAGGS-NS1_(S42P/D92E)。将重组真核表达质粒转染细胞,SDS-PAGE和Western-blot均证实NS1蛋白及其突变体蛋白在A549和293T细胞中成功表达。间接免疫荧光试验表明,NS1及其突变体蛋白均主要分布在A549细胞核中,仅有少量分布于细胞浆。此外,试验证明另一株A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)分离株的NS1及其突变体蛋白也主要分布于细胞核中,说明点突变不影响SIV NS1蛋白的细胞定位。进一步利用荧光定量PCR和ELISA方法检测A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分离株NS1点突变蛋白拮抗细胞中干扰素表达的影响,结果表明,pCAGGS-NS1_(S42P)转染组能够明显增强IFN-βmRNA、IFN-αmRNA转录水平(P0.01;0.01P0.05),但对TNF-αmRNA转录水平无明显影响(P0.05)。而pCAGGS-NS1D_(92E)和pCAGGS-NS1S_(42P/D92E_转染组细胞IFN-α、IFN-β和TNF-αmRNA转录水平均无明显变化(P0.05)。试验证实NS1蛋白第42位氨基酸对拮抗宿主细胞中IFN-α/β表达具有重要作用。     

表达H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的延迟裂解型沙门菌DNA疫苗载体的构建

为了构建表达禽流感病毒H9N2亚型血凝素HA2蛋白的延迟裂解型沙门氏菌载体,本试验首先将绿色荧光片段EGFP插入到真核表达载体p YA4545中,构建重组质粒p YA4545-EGFP,并转染巨噬细胞系RAW264.7,共聚焦显微镜下观察其表达情况;再通过PCR技术扩增HA2基因,将其克隆到沙门菌载体p YA4545中,构建重组质粒p YA4545-HA2,继而转染HEK-293T细胞,收集细胞总蛋白,通过Western-blot检测HA2蛋白的表达情况;最后将重组质粒电转到沙门菌宿主χ11218中,检测重组菌对阿拉伯糖的依赖性。结果,p YA4545真核表达体系能够有效表达;重组质粒p YA4545-HA2的HA2蛋白成功表达;重组菌对阿拉伯糖具有明显依赖性。本试验成功获得了以延迟裂解型沙门氏菌为载体表达禽流感病毒HA2蛋白的菌株,为后续开发以HA2为目标抗原的新型口服疫苗奠定了基础。     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段,将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列;利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV L1和FMDV L2以及作为参考毒株的A22/India/17/77进行序列分析。结果表明,核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列,氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG βH环内,其中毒株FMDV L1和FMDV L2RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异,分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。     

嗜水气单胞菌gyrA氟喹诺酮抗性决定区的克隆与分析

研究了从病鱼体内分离的嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药性的分子机理。以 4株对诺氟沙星等氟喹诺酮类药物耐药菌株及 2株敏感菌株为模板 ,参照杀鲑气单胞菌gyrA基因序列 ,设计了 1对引物 ,进行 gyrA基因氟喹诺酮抗性决定区PCR扩增 ,将扩增产物克隆入pMD1 8 T载体 ,转化入大肠埃希氏菌DH5α中 ,小提质粒 ,酶切鉴定 ,测序并分析比较耐药菌和敏感菌的氨基酸残基序列 ,发现耐药菌有 5个氨基酸突变位点 ,分别是 83位点的Ser→Ile,92位点的Leu→Met,1 74位点的Ile→Phe,2 0 2位点的Asn→Asp ,2 0 3位点的Leu→Arg ,耐药菌突变后的氨基酸残基均比敏感菌正常的相对应氨基酸残基分子量大。 83位点的突变与大肠埃希氏菌的耐药性突变一致 ,1 2 2位点具有保守的Try。     

Loop EF区嵌合猪细小病毒B细胞表位对猪圆环病毒2型病毒样颗粒组装的影响

Loop EF是猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的重要Loop结构,然而它在PCV2组装过程中的作用仍不清楚。本研究通过模拟PCV2病毒样颗粒(VLPs)3D结构,比较分析PCV2和PCV1、PCV3的氨基酸序列以及预测Loop EF的突变位点,筛选出PCV2 Loop EF中可供外源表位替换或插入的capsid表面位点,即第133位丙氨酸。探索性地针对该位点设计3个突变体,分别为猪细小病毒1型(PPV1)B细胞线性表位(228QQITDA233)插入PCV2 Cap第132和133位氨基酸、第133和134位氨基酸之间及替换第133位氨基酸。利用over-lap PCR等技术构建上述3个突变体的重组质粒,在大肠杆菌(BL21/DE3)中表达,并利用镍柱亲和层析纯化3个突变体蛋白,最后在体外进行VLPs组装,电镜结果显示3个突变体蛋白均可体外组装成完整的VLPs。结果表明,Loop EF中第133位丙氨酸的替换或插入外源表位突变不影响VLPs组装,提示PCV2 VLPs Loop EF展示外源抗原表位具有可行性。     

小鼠AIM2分子结构特征及天然免疫模式识别功能的研究

应用RT-PCR技术,从小鼠脾淋巴细胞中克隆AIM 2基因,通过生物信息学软件对AIM2的遗传演化关系、分子结构特征以及氨基酸序列进行分析,并应用q RT-PCR检测在不同组织中的m RN A转录水平。结果显示,克隆的小鼠AIM2基因开放阅读框全长1 065 bp,编码354个氨基酸,与其他动物的AIM2基因序列具有较高的同源性(56.9%~88.9%);q RT-PCR检测表明,AIM2基因在肌肉和心脏组织中转录水平较高。此外,将AIM2基因亚克隆至真核表达载体p CMV-Tag 2B进行W estern-blot验证,然后将正确的重组表达质粒转染H EK 293T细胞,进而应用双荧光素酶报告系统检测证实在poly(d A-d T)和poly(d G-d C)刺激下,过表达小鼠AIM2对转录因子NF-κB和AP-1的活化过程有显著增强作用。上述研究结果表明,小鼠AIM2能够识别富含A/T或C/G的D NA,是重要的胞浆DNA识别受体,这为进一步探讨AIM2与DNA病毒的相互作用机制奠定基础。     

牛脊柱畸形综合征HRM-非标记探针检测方法的建立与应用

为建立用于牛脊柱畸形综合征(CVM)检测的高分辨率熔解曲线(HRM)非标记探针法,根据Gen Bank中SLC35A3基因序列设计PCR引物及非标记性探针,构建G/G型、G/T型、T/T型3种标准质粒,利用质粒作为标准品建立HRM特征图谱。采用优化的HRM-非标记探针法对305份荷斯坦奶牛血样及冷冻精液样品中SLC35A3位点的基因型进行检测,同时采用测序法进行验证。结果,305份样本中9份冻精样本为CVM携带者,携带率为2.95%,检测结果与测序法检测结果一致,准确率达100%。上述研究结果表明,本研究建立的针对牛CVM中SLC35A3基因G-T位点突变检测的HRM-非标记探针方法是一种简单快速、灵敏特异、高效准确的牛CVM有害基因分型检测技术。     

RGD基序邻近氨基酸突变对口蹄疫病毒O/JC/2010株毒力的影响

为了研究RGD基序邻近氨基酸位点对口蹄疫病毒毒力的影响,利用O/JC/2010株病毒的基因组全长cDNA分子克隆,置换O/HN/93株病毒的VP1基因,拯救获得了1株嵌合病毒(pBlue-HJ);除此之外,在O/JC/2010VP1的3个氨基酸位点进行突变P142T、A152D、Q153P,分为4组,拯救出4株突变病毒:pBlue-HJ(142)、pBlue-HJ(142+152)、pBlue-HJ(152+153)、pBlue-HJ(142+152+153)。比较这5株病毒的LD50和TCID50特性,发现P142T、A152D可以增强口蹄疫病毒对BHK-21细胞和乳鼠的致病力,而Q153P则相反。该试验证明RGD基序附近的非保守氨基酸位点对口蹄疫病毒的毒力存在影响,为进一步阐明口蹄疫病毒的分子致病机制奠定了基础。     

大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位基因的克隆与鉴定

根据已发表的大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位 (FedF/ab)的基因 (fedF/ab)序列 ,设计了 1对引物 ,利用PCR技术从大肠埃希氏菌F10 7/ 86、YCED1、YCED2、C、D和 12F株中分别扩增获得了一段序列 ,并克隆至 pGEM T载体 ,获得了重组质粒TF10 7F、TYCED1F、TYCED2F、TCF、TDF、T12FF。经琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析 ,6个重组质粒的大小均为 90 3bp ,与fedF/ab基因大小一致。其中大肠埃希氏菌F10 7/ 86、YCED1、C和 12F株的fedF基因序列完全相同 ;只有YCED2株在第 181位碱基处存在 1个C→T的无义变异差异 ,D株在第 6 5 5位碱基处存在 1个T→C变异差异并在氨基酸水平出现 1个S→P变异。结果表明 ,所克隆的序列均为F18ab菌毛F亚单位的基因     

p53基因RNA干扰载体的构建及其在ST细胞系中的稳定表达

利用质粒介导的RNA干扰技术,建立稳定沉默p53基因的ST细胞系。通过改造p EGFP-C1载体,构建了猪源U6启动子启动编码p53 sh RNA序列的载体,将其转染ST细胞,用G418筛选细胞,并分析获得细胞的生长特性。RT-PCR和Western-blot结果显示,质粒介导的sh RNA有效地沉默了p53基因的表达;流式细胞术和细胞生长特性分析结果显示,与对照组细胞相比,p53基因沉默组ST细胞处于S期的细胞数量增多,而且p53基因沉默组ST细胞生长较快。本研究结果证实质粒介导的sh RNA高效、稳定地沉默了ST细胞中p53基因的表达。     

表达EGFP蛋白新型重组新城疫病毒疫苗载体的构建

为构建新型新城疫病毒(NDV)载体疫苗,前期我们将La Sota全长c DNA中的F基因编码区替换为基因Ⅶ型NDV的F基因编码区,并将其裂解位点突变为弱毒株的序列,构建获得了p NDFLSP-m F重组质粒。为探索p NDFLSP-m F是否能够作为载体有效地表达外源蛋白,在p NDFLSP-m F的P基因与M基因之间引入PmeⅠ酶切位点,并将EGFP基因编码区克隆至构建好的p NDFLSP-m F载体中,构建含有EGFP基因的重组质粒p NDFLSP-m F-EGFP。将p NDFLSP-m F-EGFP以及辅助质粒p CI-NP-K、p CI-P-K、p CI-LK共转染表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞,拯救获得了重组病毒La Sota-m FEGFP。通过RT-PCR证明,被拯救的重组病毒中含有插入的外源基因EGFP。荧光观察和Western-blot分析结果表明,EGFP蛋白能在重组病毒中稳定表达。生物学特性测定结果显示,La Sota-m F-EGFP具有低毒力毒株特征,MDT为144 h,能够在鸡胚上有效地复制,EID50为1×108.75/0.1 m L。上述研究结果为研制和开发新型NDV载体疫苗奠定了基础。     

猪水泡病病毒结构蛋白编码区核苷酸的序列测定与分析

以猪水泡病病毒 (Swinevesiculardiseasevirus ,SVDV)HK’70为材料 ,用特异性引物扩增出P1区的 2个重叠目的片段 ,连接于pMD 18 T载体 ,转化JM 10 9感受态细胞。经重组质粒的双酶切 ,PCR鉴定后测序。序列分析表明 ,HK’70P1区核苷酸组成中A含量较高 ,G C含量较低 ,且A G、C T转换率较高。P1序列同源性分析表明 ,SVDVHK’70与J1’73、H/3’76、SVDV(Seechurn等测株 )、NET/1/92的核苷酸序列同源性分别为 97.8%、98.1%、97.6 %和 89.3% ;相应地 ,推导的氨基酸序列同源性分别为 98.8%、98.7%、98.8%和 96 .5 %。     

野鸭源H3N8亚型禽流感病毒的系统进化和分子遗传特征分析

为了解在江苏某湿地野生水禽中分离到的1株禽流感病毒的来源、流行特点、进化和分子遗传特征,将采集的野生水禽粪便经处理后,使用A型禽流感通用荧光RT-PCR检测,阳性样品接种10日龄SPF鸡胚,收取接种后第24~96小时的尿囊液,进行血凝试验,随后对其进行全基因测序和遗传进化分析。结果显示,该毒株为H3N8亚型禽流感病毒,命名为A/Mallard/Xuyi/14/2015(H3N8)。HA蛋白的裂解位点氨基酸序列为PEKQTR↓GLF,无连续碱性氨基酸插入,符合典型低致病性禽流感病毒的特征;HA与NA的糖基化位点没有发生突变;NA耐药性氨基酸位点出现突变位点;PB2蛋白第627和701位氨基酸分别为谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asn),是禽源流感病毒的特征性氨基酸。在Gen Bank中对该毒株进行序列比对分析,结果显示,与所测基因片段同源性最高的10株毒株基本位于我国东部候鸟迁徙路线上。结果表明,A/Mallard/Xuyi/14/2015(H3N8)株为从江苏分离的低致病性禽流感病毒,基因主要来源于我国东部候鸟迁徙路线上的禽流感病毒。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其应用

采用活病毒免疫,常规杂交瘤融合的方法,获得了4株针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/duck/Shandong/093/2004(A/D/SD/04)株血凝素(HA)的单克隆抗体A8E8、D2F8、A8C8和C3G4。其中A8E8可以与11株不同来源的H5N1AIV发生交叉免疫抑制性反应(HI),具有广谱性。采用间接免疫荧光试验(IFA),用A8E8单克隆抗体测定A/D/SD/04株对COS1和MDCK2种细胞的半数感染量(TCID50),结果显示,A/D/SD/04株在COS1上的TCID50为10-5.33/0.1mL,在MDCK上的为10-7.33/0.1mL。将编码A/D/SD/04株的HA基因质粒与PR8质粒共转染COS1细胞后,用A8E8进行IFA,能观察到特异性绿色荧光,这与鸡胚接种结果相符。表明,用此单克隆抗体能准确地检测到H5重组病毒。     

禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白多克隆抗体的制备及其在乳酸乳球菌中的表达

将编码禽戊型肝炎病毒(a HEV)衣壳蛋白的ORF2基因片段克隆入原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组质粒p ET-30a(+)-ORF2。质粒经鉴定正确后转化入大肠杆菌Rosseta中筛选阳性菌,阳性菌经IPTG诱导后检测目的蛋白表达情况。用表达的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA检测抗体效价。将衣壳蛋白主要抗原区域ORF2Δ250(251~606 aa)基因片段克隆入乳酸菌表达载体p TX8048中获得阳性质粒p TX8048-ORF2Δ250,质粒电转化入宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中筛选阳性菌p TX8048-ORF2Δ250/L.lact is NZ9000。阳性菌经Nisin诱导后采用West ern-blot检测目的蛋白表达情况。结果表明,a HEV衣壳蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,制备的多克隆抗体效价为1∶216。重组菌p TX8048-ORF2Δ250/L.lactis NZ9000经Nisin诱导后,Western-blot检测到约55 ku的目的蛋白。上述研究结果将为鸡戊型肝炎乳酸菌疫苗研究提供参考。     

鼠伤寒沙门菌SL1344 sseK2基因的克隆表达及生物信息学分析

为研究鼠伤寒沙门菌SL1344株SseK2蛋白的生物学特性,通过PCR扩增sseK2基因,构建原核表达质粒pET-32a-sseK2,经大肠杆菌BL21(DE3)表达、纯化后经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,对sseK2基因编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,鼠伤寒沙门菌SseK2蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,纯化获得较高纯度的蛋白。生物信息学分析显示,SseK2蛋白为可溶性蛋白,由348个氨基酸组成,分子质量约39.57 ku。该蛋白不含信号肽、无跨膜区,为膜外蛋白,包含4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、56个磷酸化位点、15个B细胞线性结合位点和8个T细胞结合位点以及10个二硫键。其蛋白二级结构中以α-螺旋(Hh)占33.05%,无规则卷曲(Cc)占27.30%为主。成功构建了原核表达载体,并对其进行生物信息学分析,为进一步研究sseK2基因的生物学功能及在沙门菌致病机制中的作用奠定了良好基础。     

三株鸭源H9N2亚型禽流感病毒福建株全基因的测序及遗传进化分析

为明确3株鸭源H9N2亚型禽流感病毒福建株A/Muscovy duck/Fujian/CL/1997(H9N2)(简称CL株)、A/duck/Fujian/MH/2003(H9N2)(简称MH株)和A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)(简称FQ2株)全基因组的分子特征和遗传进化情况,采用RT-PCR方法扩增这3株病毒全基因片段,并进行序列比较及遗传进化分析。结果表明,所克隆的8个基因片段均有完整的开放阅读框,其血凝素基因蛋白裂解位点的氨基酸组成为-RSSR*GLF-,为不连续的碱性氨基酸,其静脉接种指数远小于1.2,均符合低致病性AIVHA蛋白裂解位点特征;CL株和MH株的HA基因在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94群系;FQ2株HA基因在遗传进化上属于DK/HK/Y280/97群系,3株H9N2亚型AIV HA基因在遗传进化上均属于经典的欧亚种系。3株H9N2亚型AIV NA基因颈部均存在缺失,CL株和MH株的NA基因在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94群系,FQ2株NA基因在遗传进化上属于G1群系。CL株和MH株的其他6个基因在遗传进化上均和经典的CK/BJ/1/94一致,而FQ2株则可能是由不同流感病毒基因亚系间发生自然重排的产物。     

黑龙江省和河北省鸡新城疫病毒分离株的遗传变异分析

利用 RT PCR 技术扩增出了 4 株 NDV 分离株(HeB 4 99, HeB 5 99、HeB 6 02 和HLJ 10 02)F基因539 bp的片段,将该片段克隆到 pMD 18 T载体上。经酶切分析、质粒 PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得了4株 NDV分离株 F基因部分片段的重组质粒。同源性分析显示,4株分离毒株的核苷酸序列具有 95.9%~100%的同源性,与 LaSota的核苷酸序列同源性为81.0%~81.8%,与F48E9的核苷酸序列同源性达85.8%~89.3%。推导氨基酸序列分析表明,4个毒株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112RRQKRF117,具有强毒株裂解位点氨基酸组成特点,与ICPI和MDT测定结果相吻合。73株NDV毒株的系统发育进化树分析表明,HeB 4 99、HeB 5 99、HeB 6 02和HLJ 10 02均归属于基因Ⅶ型。     

H9亚型禽流感病毒分离株A/Chick/Shandong/6/96的基因序列分析

对1株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)A/Chick/Shndong/6/96(H9N2)进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因的核苷酸序列皆与1994年分离株A/Chicken/Beijing/l/94(H9N2)具有很高的同源性(96.0%-98.6%);推导其血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为A-R-S-S-R,完全符合H9 AIV欧亚分支中的类A/chicken/Beijing/1/94亚分支的特征;虽然其神经氨酸酶(NA)基因与A/Chicken/Beijing/l/94(H9N2)相比,出现了9个核苷酸的缺失,然而其同源性仍然较高,为97.3%;而与欧亚分支中的类A/Chicken/Korea/323/96和类A/Quail/HongKong/G1/97亚分支的同源性却相对较低,分别为92.0%和84.2%;其它基因的比较情况也大体相近.提示该毒株是由1994年分离株进化而来,在遗传演化上属于H9亚型流感病毒欧亚分支中的类A/Chicken/Beiing/l/94(H9N2)亚分支.     

牦牛MBL2基因3′-UTR区抗菌相关SNPs的筛选

为了筛选牦牛MBL2基因3′-UTR区与抗菌有关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),本研究通过扩增青藏高原521头牦牛血液中MBL2基因3′-UTR区,并分别进行测序,利用DNAMAN8.0、CHROMAS 2.6.6和Haploview软件对序列进行SNPs预测和连锁不平衡分析,使用ELISA检测试剂盒分别检测血清中多杀巴氏杆菌和布氏杆菌抗体D_(450)值,利用SPSS分析SNPs与多杀性巴氏杆菌和布氏杆菌血清抗体D_(450)值的相关性,并通过miRWalk和RNA 22数据库对靶向牦牛MBL2基因3′-UTR区的miRNAs进行预测筛选。结果显示,牦牛MBL2基因3′-UTR区SNP大小为861 bp,预测存在A997C、T1295C、A1473T、C1511T和C1540T共5个SNPs,其中A997C和T1295C、A1473T和C1540T位点强连锁不平衡,A997C/T1295C位点CC/CC基因型与多杀性巴氏杆菌抗体D_(450)值的相关性显著高于AA/TT基因型和AC/TC基因型(P0.05);共预测到223个靶向牦牛MBL2基因3′-UTR区的miRNAs,其中12个miRNAs分别靶向T1295C、A1473T、C1511T和C1540T位点。结论,牦牛MBL2基因3′-UTR区A997C/T1295C位点多态性可能与牦牛抗多杀性巴氏杆菌性状具有相关性,12个miRNAs可能通过靶向T1295C、A1473T、C1511T和C1540T位点参与牦牛MBL表达水平调节。