A型流感病毒PB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以A型流感病毒A/Chicken/Zhejiang/YH/2/2013(H7N9)的PB1基因为模板,扩增其1519～2274bp间的片段,并构建原核表达载体pET-28a(+)-H7N9-sPB1。通过大肠杆菌原核表达获得重组蛋白His-sPB1后,以其作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合筛选获得3株能够稳定分泌单克隆抗体的细胞株5G5、2H3和5E8。Western-blot和IFA检测表明,3株单克隆抗体对于不同亚型的流感病毒均具有良好的反应性。免疫共沉淀结果表明,3株单克隆抗体能用于免疫共沉淀试验。A型流感病毒PB1蛋白单克隆抗体的制备为进一步研究PB1蛋白的结构与功能以及流感病毒的监测与诊断提供了必要的工具。     

蓝舌病病毒NS2蛋白单克隆抗体的制备及其应用

本研究旨在制备针对蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)非结构蛋白NS2的单克隆抗体,进而用于C-ELISA鉴别BTV自然感染动物与BTV灭活疫苗免疫动物。通过原核表达BTV NS2蛋白的高保守多肽(1~228 aa)来制备抗原,并通过免疫BALB/c小鼠制备抗BTV NS2蛋白的单克隆抗体,结果,获得1株分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞,命名为BTV-2A4。鉴定结果显示,该单克隆抗体的亚类/亚型为IgG1/κ;其抗原表位在NS2蛋白的91~138 aa区间;能特异性地与1~24型BTV的NS2蛋白反应;可应用于Western-blot、间接免疫荧光、间接ELISA及C-ELISA技术。C-ELISA应用的试验数据表明,BTV疫苗免疫动物及未被BTV感染动物的血清中检测不到NS2抗体,而BTV感染动物的血清中大多可被检出NS2抗体。     

猪瘟病毒NS3蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

以含有猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA的重组质粒pOKShimen为模板,经PCR扩增获得NS3基因,利用原核表达载体pMAL-c2X、pET32a以及杆状病毒表达载体pFastBacH T B表达CSFV石门株NS3基因,获得3种重组蛋白:MBP-NS3、His-NS3和rNS3。Western-blot分析及间接免疫荧光试验证实,这3种不同载体表达的NS3蛋白均能被猪瘟阳性血清所识别。利用直链淀粉树脂柱对重组蛋白MBP-NS3进行纯化后,用其免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA筛选,获得2株能稳定传代并分泌针对抗CSFVNS3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为1D10和1H10。Western-blot分析及间接免疫荧光试验结果证明,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可识别CSFVNS3蛋白。     

A型禽流感病毒NS1蛋白的表达及其诱导细胞凋亡功能的研究

利用瞬时表达方法表达禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,并初步研究了体外表达的NS1蛋白对宿主细胞凋亡的影响.应用脂质体介导法,将含有不同亚型AIV NS1基因的阳性质粒pcDNA3.1(+)-qNS1(H5N1)、pcDNA3.1(+)-rNS1(H9N2)转染Vero细胞系及MDCK细胞系.经SDS-PAGE及Western-blotting检测,qNS1和rNS1基因在Vero细胞及MDCK细胞中均获得了表达.应用AO/EB荧光染色法、Annexin V-PI法分别对转染后的Vero细胞及MDCK细胞进行细胞凋亡检测,结果显示,转染阳性质粒的MDCK细胞凋亡率增高,而转染空载体pcDNA3.1(+)的MDCK细胞及转染的Vero细胞均无明显变化.表明,qNS1、rNS1蛋白在体外培养的MDCK细胞中表达并能够诱导其发生凋亡,而在Vero细胞中却不能发挥此功能.     

抗鹅细小病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及对应抗原表位区的分析

以鹅细小病毒非结构蛋白NS1(GPV-NS1)的重组质粒pcDNA3.1-GPV-NS1及纯化的重组蛋白GPV-NS1为抗原,分组免疫4～6周龄的BALB/c鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并研究其部分生物学特性.结果共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株.单克隆抗体亚型鉴定结果显示,2株为IgG2a型,4株为IgM型,轻链均为κ链.用制备的单克隆抗体对分段表达的NS1蛋白进行免疫印迹分析,结果鉴定出3个抗原表位区,分别位于NS1蛋白的第453～514 aa、485～542 aa、533～598 aa区段.证实,6株杂交瘤细胞在体外长期培养能稳定地分泌抗GPV-NS1单克隆抗体.     

抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体,以含Asia1型FMDV/JS/05毒株3B基因的pCAGGS-3B质粒为模板,扩增3B蛋白基因,并克隆至pET-30a(+)载体,进行原核表达及纯化。分别以Asia1型口蹄疫病毒、纯化的3B蛋白为抗原,免疫4~6周龄的雌性BALB/c小鼠,经过4次免疫后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5∶1~10∶1进行细胞融合,用本实验室建立的间接ELISA对融合后的细胞进行筛选,并进行4次有限稀释筛选出的阳性细胞扩大培养后,注射小鼠腹腔,制备腹水。对制备的腹水进行类别鉴定、反应原性和效价鉴定。结果表明,获得1株能稳定分泌抗Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白的细胞株,其抗体类别为IgM,腹水效价为1∶12 800,通过Western-blot和间接免疫荧光试验,确定其能识别口蹄疫病毒3B蛋白。     

口疮病毒VIR蛋白多克隆抗体的制备及VIR蛋白的亚细胞定位观察

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western-blot鉴定抗体的反应原性。利用脂质体介导法将pEGFP-VIR质粒转染绵羊睾丸细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后激光扫描共聚焦显微镜观察VIR在细胞内的表达和亚细胞定位。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GSTVIR蛋白,主要以可溶性形式存在,其分子质量约27ku,制备的多克隆抗体效价达1∶218;Western-blot分析结果显示,此多克隆抗体有较好的特异性反应;VIR蛋白主要定位于细胞核内。本试验结果为VIR生物学功能的深入研究奠定了基础。     

猪圆环病毒4型Cap蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

为了研究猪圆环病毒4型(porcine circovirus type 4,PC V4)Cap蛋白功能,本研究构建了其原核表达质粒pCzn1-Cap,并对其进行了诱导表达和蛋白纯化.以纯化的重组蛋白His-Cap作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫后的小鼠脾细胞融合,通过ELISA筛选得到了 ...     

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用纯化的猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗EMCV VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10B和11D。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1 600和1∶800,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗的亚类均为IgG2a,均能特异性识别重组VP1蛋白,但它们识别VP1蛋白的不同表位。间接免疫荧光和免疫组织化学试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别EMCV。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

用灭活O型口蹄疫病毒为抗原免疫BALB/c小鼠4次后,取致敏的脾B淋巴细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,经间接ELISA法筛选,最终获得了3株抗O型FMDV的阳性杂交瘤细胞株,命名为2F1、2G7和6H4。血清学试验证明该McAbs能与FMDV抗原结合,具有高度特异性。     

鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其对应抗原表位区的分析

为获得抗鹅细小病毒(GPV)VP1蛋白的单克隆抗体,以纯化的VP1蛋白为免疫原,免疫4～6周龄的雌性BALB/c鼠,经4次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,共获得5株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。Western-blot结果表明,这5株杂交瘤细胞分泌的抗体均能特异地与纯化后的GPV-VP1重组蛋白发生反应,单克隆抗体亚型鉴定结果表明,3株单抗为IgG1亚型,1株单抗为IgG2b亚型,1株单抗为IgA亚型,轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析,结果鉴定出3个抗原表位识别区,分别位于VP1的第92～123、92～145和111～145aa。证实,这5株杂交瘤细胞在体外长期培养能稳定地分泌抗GPVVP1的单克隆抗体。     

野鸭源新城疫病毒V蛋白基因在DF-1细胞中的表达及V蛋白的亚细胞定位

为研究野鸭新城疫病毒V蛋白基因在真核细胞中的表达及V蛋白的亚细胞定位,将新城疫病毒V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-V重组表达质粒,经脂质体转染DF-1细胞后,用Western-blot验证该基因在DF-1细胞中的表达;用激光共聚焦显微成像技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,重组质粒pcDNA3.1-V在外源真核细胞DF-1中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。研究结果为进行野鸭源新城疫病毒V蛋白的功能研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,共获得6株能稳定分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/7B6和6G7/8D3,并通过ELISA、Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对6株单抗的特性和抗原表位进行分析鉴定。结果显示,6株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024～1∶2 048,腹水效价为1∶163 840～1∶204 800。3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3的亚型为IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7为IgG2b型,所有单抗的轻链均为κ型。Western-blotting和IFA结果表明6株单抗均能与重组Cap蛋白和PCV2产生特异性反应。相加ELISA结果显示,6株单抗可能识别不同的抗原表位。为准确鉴别不同单抗针对的抗原位点,以截短表达的重组Cap蛋白为抗原,进行Western-blot鉴定。结果显示,4A9/3E2与4A9/3D7的抗原表位位于101～150aa,其余4株单抗可能针对1～50aa或者天然...     

猪细小病毒1型VP2蛋白的表达与单克隆抗体的制备及应用

为研制抗猪细小病毒1型(PPV1)VP2蛋白的单克隆抗体,用重组杆状病毒表达的PPV1VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,融合后采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验筛选抗PPV1VP2的单克隆抗体阳性细胞株,并对单克隆抗体的腹水效价、免疫反应特性及亚类进行了系统鉴定。结果显示,共获得8株阳性杂交瘤细胞株,其腹水抗体效价均达1∶51 200,其中7株的重链亚类为IgG1,另1株(4A1)为IgM;6株的轻链为κ型,另2株(8D7和4A1)为λ型。这些单克隆抗体均可与PPV1感染的猪睾丸细胞呈阳性反应;Western-blot结果显示,这些单克隆抗体可与自然PPV1VP2蛋白产生良好的免疫反应。以其中1株单克隆抗体(8E4)建立了间接ELISA,通过对重组杆状病毒表达的PPV1VP2蛋白产物进行的动力学检测表明,第72小时蛋白表达量最高;对PPV1感染细胞增殖规律的测定结果显示,接种后第16小时可检测到病毒感染的阳性细胞,说明该病毒复制周期小于24h。本研究获得的单克隆抗体可用于重组VP2蛋白抗原的检测及病毒繁殖规律的研究。     

非洲马瘟病毒NS1蛋白在昆虫细胞中的表达及抗原性分析

非洲马瘟（African horse sickness,AHS）是一种由媒介昆虫传播感染马属动物的病毒性疾病,为了在杆状病毒表达系统中表达AHSVNS1蛋白并评估其作为亚单位疫苗组分的抗原性,本研究参考GenBank上公布的AHSV基因序列,人工合成NS1全长基因序列,利用PCR方法扩增完整的开放阅读框后将其克隆到转座载体pFastBacTMHTb上,将成功构建的重组质粒pFastBac-AHSVNS1转化到DH10Bac感受态细胞中,获得了含有AHSVNS1基因的重组杆粒Bacmid-AHSVNS1,将其转染到Sf9昆虫细胞内获得了表达AHSVNS1蛋白的重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,表达的重组AHSV NS1蛋白大小为65 ku,且获得了纯化的重组AHSV NS1蛋白。将其免疫BALB/c小鼠,细胞免疫荧光和Western-blot试验显示获得了特异性的抗AHSV NS1蛋白多克隆抗体,其效价达1∶51 200。流式细胞分析显示,AHSV NS1蛋白免疫小鼠能够刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞的增加。上述研究结果表明,AHSV NS1蛋白作为AH...     

禽坦布苏病毒截短E蛋白单克隆抗体的制备及其抗原性分析

为制备禽坦布苏病毒囊膜E蛋白截短蛋白的单克隆抗体并分析其抗原性,以坦布苏病毒YY1分离株的cDNA为模板,通过RT-PCR扩增编码截短E蛋白的基因,并将其成功克隆到原核表达载体pET-28a(+)中。重组载体pET-28a(+)-YY1E转化的大肠杆菌BL21(pLysS)在IPTG诱导下高效表达重组蛋白His-YY1E,该蛋白可与坦布苏病毒感染鸭的血清反应。用纯化的His-YY1E免疫小鼠制备单克隆抗体,采用有限稀释法经过3轮筛选和鉴定最终获得了2株分泌抗E蛋白的单克隆抗体细胞株1C5和3B11。制备的单克隆抗体与原核表达和病毒感染细胞中的E蛋白均能反应。进一步通过转染截短蛋白E不同区域截短体与pEGFP-C3构建的重组载体,并经IFA检测,发现单克隆抗体1C5和3B11识别的截短E抗原区域位于C端35个氨基酸(105个碱基)之间。本研究为进一步研究坦布苏病毒E蛋白的功能,研制坦布苏病毒病亚单位疫苗以及建立快速特异的坦布苏病毒检测方法奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒EP0蛋白单克隆抗体的制备及其应用

本研究使用纯化的His-EP0重组蛋白免疫BALB/c小鼠,在其血清效价达到要求后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,通过ELISA方法筛选获得了3株能够稳定分泌抗EP0蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C5、4C6和3B5。经单抗亚型试验鉴定,发现2C5为Ig G2b/κ型,3B5和4C6均为Ig G1/κ型。叠加ELISA结果证明,2C5、4C6和3B5针对EP0蛋白不同的抗原表位。IFA结果表明,2C5和4C6能够与PRV感染的细胞发生特异性反应,而不与PRV-△EP0感染的细胞反应。综上所述,本研究成功制备了3株针对RPV EP0蛋白的单克隆抗体,为进一步研究EP0蛋白功能提供了重要的实验材料。