禽呼肠孤病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立一种能够高效鉴别禽呼肠孤病毒（ARV）的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法,本研究根据NCBI数据库中ARV S1基因保守区的序列,设计了1对特异性检测引物和1条MGB探针,通过优化反应条件,建立了用于检测ARV的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,该方法特异性好,对鸡常见传染性疾病病原的检测结果均为阴性;灵敏度高,可以达到10 copies/μL;稳定性好,组间和组内试验的变异系数小。本研究首次建立了ARV TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法,该方法具有快速、简便和敏感性高等优点,为ARV的快速检测诊断提供了新的方法。     

泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为泛素基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中公布的泛素基因序列设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测泛素基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法的线性关系好,以质粒标准品构建的标准曲线的相关系数r~2为0.999;灵敏性、特异性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检测出不同类型细胞中泛素的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测泛素TaqMan实时荧光定量PCR方法。     

羊痘病毒实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

参照羊痘病毒(CaPV)P32的基因序列,设计合成了2套引物和1条探针,建立了实时荧光定量PCR技术,对细胞培养物、皮肤丘疹、痂皮等组织病料中的GPV进行了特异性检测和敏感性试验。结果显示,用300 nmol／L引物浓度和200 nmol／L探针浓度,获得的Cr值较小,而△Rn最大;可检测到相当于0．1 TCID50的病毒DNA;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0．999 5以上;组内和组间试验重复性的变异系数分别为2．3％和3．4％;与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,可同时检测大量样品等优点。表明。荧光TaqMan PCR是一种检测CaPV的良好方法,可对组织病料中低含量的CaPV或持续带毒宿主进行准确检测。     

兔出血症病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据RHDV VP60基因保守序列设计1对特异性引物和1条探针,进行条件优化,检测重复性、敏感性和特异性,建立了RHDV TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,标准品浓度在2.8×10~6~2.8×10~2 copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.8×10~1copies/L的标准品阳性质粒,变异系数小于2%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的RHDV,为我国RHDV的检测及其定量检测的相关研究提供了一种可靠的技术工具。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

为建立一种CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为CD63基因的动态检测提供有效的实验手段,根据GenBank中公布的CD63基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测CD63基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.997;灵敏性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检出不同类型细胞中CD63的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测CD63基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法。     

牛诺如病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

牛诺如病毒(BNoV)是国内新发的犊牛腹泻的病原,为建立高效快速、特异的BNoV定量检测方法,本研究参照GenBank登录的BNoV的RdRp基因的保守序列,设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过优化反应条件和体系,建立了BNoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法选择的引物具有高度特异性,只对BNoV有特异性扩增,而对牛冠状病毒等4种犊牛腹泻常见病原未见扩增;对BNoV核酸最低检测限为15.9 copies/μL,且批内、批间变异系数均小于2%,重复性好。对采集自2017年9月至2019年11月河南、山东和四川省的261份犊牛腹泻样本进行检测,结果显示BNoV的阳性检出率为11.49%(30/261)。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法对BNoV的病原检测和流行病学调查具有重要意义。     

鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为鼠源VCAM-1基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中登录的鼠源VCAM-1基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测鼠源VCAM-1基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.998;灵敏性、重复性及特异性均较高。可用于鼠源细胞中VCAM-1基因的定性鉴别和含量测定。结果表明,成功建立了一种快速准确检测鼠源VCAM-1基因的TaqMan实时荧光定量PCR法。     

溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、准确检测猪溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,优化反应条件,建立了检测溶血性曼氏杆菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,以重组质粒pMD-MH-16S为标准品建立的标准曲线在3.06×10~8~3.06×10~1copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到3.06×101 copies/L的标准品阳性质粒。该方法与其他24种常见细菌均无交叉反应,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的方法和普通PCR方法对65份临床样品进行检测,阳性率分别为56.92%和21.54%,阳性符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于牛、羊溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。     

犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。     

猪脑心肌炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的检测方法,根据GenBank中EMCV 3D基因的保守序列设计并合成1对引物和1条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了该病毒的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。该方法线性关系好,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数达到0.998;敏感性高,检测下限为10copies/μL,比普通PCR敏感100倍;特异性强,只有EMCV呈阳性,而与猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、BHK-21正常细胞均无交叉反应;重复性好,组内与组间的变异系数均小于1.5%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株人工感染小鼠的脑、心、脾中的病毒载量进行了检测,同时对临床采集的153份可疑病料进行了检测。结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于EMCV的检测及定量分析。     

内蒙古绵羊梅迪-维斯纳病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种检测内蒙古地区绵羊梅迪-维斯纳病毒(MW)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据高度保守的gag基因序列设计特异性引物和探针,通过对反应条件和反应体系的优化,建立了快速检测MW的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果显示,扩增相关系数为0.999,对重组标准质粒的最低检测量为1.0×100 copies/μ...     

肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据肺炎克雷伯菌16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR。结果显示,该方法与猪肺炎支原体、猪鼻支原体、臭鼻克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、肠球菌、乳杆菌、解淀粉芽胞杆菌、猪丹毒杆菌、奇异变形杆菌和化脓隐秘杆菌共15种细菌无交叉反应;标准品浓度在2.29×109~2.29×104 copies/μL范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.29×102 copies/μL的标准品阳性质粒;批内和批间变异系数均小于3%。临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强和检测快速的优点,可用于肺炎克雷伯菌感染的早期诊断、样品的快速检测以及肺炎克雷伯菌的定量分析。     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏检测鸡毒支原体(MG)的方法,本研究根据GenBank中登录的MK984197.1,针对PAPV基因的保守序列设计了1对特异性引物探针,将PCR扩增后的PAPV基因克隆至pMD19-T载体,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒标准品,建立鸡毒支原体TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性等进行优化与验证。结果显示,C_t值与标准模板在0.53×10⁸～0.53×10³copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R²)为0.998,线性方程的斜率为-3.219,最低检测限度为0.53×10²copies/μL;经组内和组间重复试验,两者变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性;与鸡滑液囊支原体(MS)、火鸡支原体(MM)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用所建立的MG-TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对部分地区抽检的60份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。上述结果表...     

禽多瘤病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)的快速诊断方法,根据APV VP4基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,验证了其特异性、敏感性和重复性,并利用建立的方法对采集的临床样本组织进行检测。结果显示,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1.0×10⁹～1.0×10²copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.021,检测下限为1.0×10¹copies/μL,与其他禽源病毒未发生交叉反应,重复性试验的变异系数均小于2%,重复性好,并且该方法在实际临床检测中可行。上述结果表明,建立的方法可用于禽多瘤病的早期诊断和APV快速检测。     

猪星状病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为了建立特异、灵敏及快速的猪星状病毒3型(PAstV3)检测方法并应用于临床检测,根据GenBank登录的PAstV 3序列,在ORF1b保守区设计特异性引物和TaqMan探针;经过反应体系和反应条件优化,对建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行敏感性、特异性测定,并初步应用于临床粪便样品的检测。结果显示,该方法标准曲线线性关系良好,R2值达到0.997 1;与多种常见的猪病病毒均无交叉反应,特异性良好。与常规PCR相比,该检测方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高,批内、批间重复性试验的变异系数均小于2.0%,重复性良好。使用该方法对临床收集的30份疑似PAstV3粪便样本进行检测,阳性率为40%,检出率高于常规PCR方法。上述结果表明,该方法的建立为PAstV3的诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已公布的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)N基因序列设计并合成特异的引物和TaqMan探针,构建质粒标准品,以标准品为模板建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪库布病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和口蹄疫病毒为模板时均未检测到荧光信号,表明该方法具有良好的特异性;用2.66×10~6、2.66×10~5和2.66×10~4copies/L这3个不同浓度的质粒标准品进重复试验,循环阈值Ct的变异系数均低于2%,表明该方法具有良好的特异性;标准曲线斜率为-3.461,相关系数为R~2=0.998,表明阈值和模板浓度之间具有良好的线性关系。10倍梯度稀释质粒标准品,检测的最低限度为2.66×10~1 copies/L的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对194份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示PDCoV阳性率为22.1%,明显高于常规RT-PCR的11.9%,表明该方法可应用于PDCoV的临床诊断及定量检测。     

非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速诊断方法,本研究根据ASFV SY18株p17蛋白的编码基因D117L的保守序列设计并合成引物和探针,建立了基于ASFV p17蛋白的编码基因D117L的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1×10^9~1×10^1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.192,检测下限为10 copies/μL,且与其他能引起相似症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.920 7%,重复性好。此方法可用于ASF的早期诊断和ASFV快速检测。     

塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时快速鉴别检测塞内卡病毒A(SVA)和脑心肌炎病毒(EMCV)的方法,根据SVA和EMCV高度保守的3D基因区域,分别设计了2对特异性引物和带2种不同发光基团标记的TaqMan探针,建立同时检测这2种病毒核酸的双重TaqMan荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化。结果显示,该检测方法对SVA和EMCV的最低检测量分别为760 copies/μL和98 copies/μL,并且能够特异性检测出SVA和EMCV,而对猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等检测结果均为阴性。本方法中所建立的标准曲线呈现良好的线性关系,重复性试验组内和组间变异系数均低于5%,说明该检测方法重复性高。本研究所建立的双重荧光定量PCR具有方便、快速、特异性好、灵敏度高、重复性好等优点,能够用于SVA和EMCV的同时检测。     

猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为研究miRNA在猪细小病毒(PPV)复制中的作用机制,针对PPV的NS1基因设计引物,建立了实时荧光定量PCR;用RegRNA软件和RNAhybrid软件预测能靶向PPV基因组的miRNA,将筛选出的miR-34a与miR-181a、miR-16、miR-499-5p、miR-10b、miR-18a、miR-145-5p分别转染到PK-15细胞,然后用PPV感染细胞,每隔12h取细胞上清,用实时荧光定量PCR检测PPV的DNA拷贝数。结果显示,实时荧光定量PCR的最适退火温度为59℃,熔解温度在85℃左右,质粒浓度在1.59×109~1.59×104 copies/μL时可得到较为理想的标准曲线,相关系数为0.997,扩增效率为97.2%。用该实时荧光定量PCR对日本脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行检测时均无荧光信号,表明具有良好的特异性。转染不同miRNA的细胞感染PPV后,用建立的实时荧光定量PCR检测发现miR-34a能抑制PPV的复制,其他miRNA对PPV增殖无明显影响。