表达EGFP蛋白新型重组新城疫病毒疫苗载体的构建

为构建新型新城疫病毒(NDV)载体疫苗,前期我们将La Sota全长c DNA中的F基因编码区替换为基因Ⅶ型NDV的F基因编码区,并将其裂解位点突变为弱毒株的序列,构建获得了p NDFLSP-m F重组质粒。为探索p NDFLSP-m F是否能够作为载体有效地表达外源蛋白,在p NDFLSP-m F的P基因与M基因之间引入PmeⅠ酶切位点,并将EGFP基因编码区克隆至构建好的p NDFLSP-m F载体中,构建含有EGFP基因的重组质粒p NDFLSP-m F-EGFP。将p NDFLSP-m F-EGFP以及辅助质粒p CI-NP-K、p CI-P-K、p CI-LK共转染表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞,拯救获得了重组病毒La Sota-m FEGFP。通过RT-PCR证明,被拯救的重组病毒中含有插入的外源基因EGFP。荧光观察和Western-blot分析结果表明,EGFP蛋白能在重组病毒中稳定表达。生物学特性测定结果显示,La Sota-m F-EGFP具有低毒力毒株特征,MDT为144 h,能够在鸡胚上有效地复制,EID50为1×108.75/0.1 m L。上述研究结果为研制和开发新型NDV载体疫苗奠定了基础。     

微小隐孢子虫P23基因真核表达质粒在HeLa细胞中的表达及其免疫小鼠血清抗体效价的检测

为观察微小隐孢子虫P23基因真核重组质粒在He La细胞中的表达及免疫小鼠血清抗体产生情况,通过设计特异性引物,利用PCR技术,对微小隐孢子虫卵囊基因组DNA进行P23基因扩增;将扩增产物插入真核表达载体p VAX-1中,构建重组真核表达质粒p VAX1-P23,转染He La细胞,运用间接免疫荧光法及Western-blot技术,验证重组质粒在He La细胞中的表达情况;将重组质粒p VAX1-P23免疫小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体产生情况。结果显示,成功地扩增了长度约为336 bp的微小隐孢子虫P23基因;双酶切和序列测定结果显示,构建的真核重组表达质粒p VAX1-P23中外源基因序列和插入位置正确;间接免疫荧光法及Western-blot分析显示,p VAX1-P23真核重组表达质粒在He La细胞中被成功表达;小鼠免疫重组质粒2周后,即可检测到抗体产生,直至第8周试验结束。结果表明成功地构建了真核重组表达质粒p VAX1-P23,该重组质粒能在He La细胞和小鼠体内表达,并诱导小鼠产生显著的体液免疫反应,为进一步开展隐孢子虫P23蛋白特性研究、研制抗隐孢子虫病核酸疫苗奠定了基础。     

微小隐孢子虫类钙调蛋白基因真核表达质粒的构建及在Hela细胞中的表达

为了构建微小隐孢子虫类钙调蛋白(calmodulin-like protein,CML)基因的真核表达质粒,并在Hela细胞中实现表达,以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,通过PCR扩增CML基因,插入到克隆载体pMD18-T中。对经鉴定的pMD-CML重组质粒进行双酶切,将目的基因连接到经同样内切酶双酶切的真核表达载体pVAX1上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用FuGENE HD转染试剂介导的方法,将重组表达质粒转染Hela细胞,用Western-blot技术和间接免疫荧光法检测外源基因的表达。结果显示,成功构建了微小隐孢子虫CML基因的真核表达质粒pVAX-CML,重组质粒在Hela细胞中实现了表达,表达产物具有良好的反应原性,为研究CML的特性和功能、寻找新的防控技术奠定了基础。     

小鼠Ghrelin基因真核表达质粒的构建及对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

为构建小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒,并研究Ghrelin对3T3-L1细胞增殖的影响,以小鼠肠cDNA为模板,通过PCR扩增Ghrelin基因,插入到pMD18-T克隆载体中。对经鉴定的重组质粒pMD-Ghrelin进行双酶切,将目的基因连接到经同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用Lipofectamine 3000转染试剂将重组表达质粒转染到3T3-L1细胞中,采用qRT-PCR和Real-time PCR检测Ghrelin基因在3T3-L1细胞中的表达。采用CCK-8法检测细胞的生长活力;流式细胞术检测Ghrelin基因对细胞周期和凋亡的影响;采用Real-time PCR检测部分周期相关基因的mRNA表达水平。结果显示,成功构建了小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Ghrelin,并能在3T3-L1细胞中得到很好地表达,其表达倍数是空质粒组的5倍(P0.01);转染后第48、72和96小时,Ghrelin转染组3T3-L1细胞的生长活力明显高于空载体组(P0.05或0.01);转染后第24小时,Ghrelin转染组S期细胞数量明显高于空载体组(P0.05);Ghrelin过表达对3T3-L1细胞的凋亡无明显影响(P0.05)。qRT-PCR结果显示,Ghrelin转染组细胞的c-myc(P0.05)、E2F1、CDK2(P0.05)等mRNA的表达量也明显高于空载体组,P53表达低于空载体组,差异显著(P0.05)。以上结果表明,Ghrelin过表达能显著促进3T3-L1细胞的增殖,但不影响凋亡。     

非洲猪瘟病毒NP419L基因shRNA表达质粒的构建与筛选

为构建非洲猪瘟病毒(ASFV)shRNA表达质粒,以PCR扩增出非洲猪瘟病毒NP419L基因,并插入真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组真核表达质粒pNP419L-GFP,将其转染NIH-3T3细胞,NP419L-GFP融合基因在细胞中获得表达。针对NP419L基因设计并合成5对干扰序列,将其连接到RNAi表达载体pSuper中,构建干扰质粒pSuper-shNP419L-A,B,C,D,E,将质粒pNP419L-GFP和pSu-per-shNP419L-A,B,C,D,E分别共转染NIH-3T3细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析干扰效率。结果显示,5个干扰质粒均能抑制NIH-3T3细胞中NP419L-GFP融合基因的表达,其中pSuper-shNP419L-A,B的抑制效果较好,在87%以上,与pSuper-shNP419L-C,D,E之间均存在显著性差异(P<0.05)。表明,本试验成功构建出针对ASFV NP419L基因的RNA干扰质粒,并筛选出了有效沉默NP419L基因的干扰序列,为进一步体内试验研究奠定了基础。     

鸭病毒性肝炎病毒RNA聚合酶在真核细胞中的表达及亚细胞定位

为研究鸭病毒性肝炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶的分子生物学特性及其在细胞中的定位,构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒;然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和蛋白免疫电泳试验等方法检测了RNA依赖性RNA聚合酶在细胞中的表达和亚细胞定位情况。结果表明,RNA依赖性RNA聚合酶能与增强型绿色荧光蛋白一起在MDCK细胞中良好表达,且主要分布于细胞核中,Western-blot分析结果显示,融合蛋白在80ku处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性。表明成功构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现RNA依赖性RNA聚合酶主要在细胞核中发挥复制酶的功能。     

旋毛虫P49和P53ES抗原基因的真核表达

将构建的重组质粒pEGFP-N1-P49和pEGFP-N1-P53同时进行双酶切,回收P53基因片段和pEGFP-N1-P49载体,再将P53基因片段重组到pEGFP-N1-P49中,构建旋毛虫ES抗原P53和P49融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-P49-P53,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7。于转染后第24小时在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的转基因细胞;Western-blot分析证实目的基因的表达产物具有抗原性。结果表明,成功构建了含有旋毛虫ES抗原P53和P49融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-P49-P53,并在COS-7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。     

猪IL-4稳定表达细胞系的建立

为了构建能稳定表达猪白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)的细胞系,本研究对猪IL-4基因进行了克隆,发现该基因开放阅读框(ORF)长402 bp,编码133个氨基酸,分子质量为15.02 ku,PI为8.64。与牛、绵羊、马、猫、狗和人的同源性分别为80.5%、76.7%、72.7%、72.9%、72.0%和69.2%,而与小鼠的同源性仅为41.5%。通过Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切后将p IL-4基因插入含EGFP标签的p IRES2-EGFP载体中,构建出重组质粒p IRES2-EGFP-p IL-4。该重组质粒转染猪肠上皮细胞(IPEC-J2)后,经G418阳性筛选,获得稳定表达猪IL-4的细胞系。p IRES2-EGFP-PIL-4重组质粒转染IPEC-J2细胞后第24小时,荧光定量PCR结果表明,IL-4 m RNA的表达量较对照组及空载体组极显著升高(P0.01),荧光显微镜下亦可见大量绿色荧光表达。该细胞系在连续传代28次以后,仍可见IL-4在基因水平和蛋白水平的高表达。本研究成功构建了真核表达载体p IRES2-EGFP-p IL-4和能稳定表达猪IL-4的细胞系,为进一步研究其功能奠定了基础。     

靶向enJSRV env基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效率的测定

为探讨绵羊内源性反转录病毒(enJSRV)在绵羊胚胎发育过程中的作用,利用脂质体将pEGFP-C1空载体转入绵羊绒毛膜滋养层细胞中,测定其转染效率。同时构建抑制enJSRV env基因的RNA干扰质粒,并将其转染到能稳定表达enJSRV env基因的绵羊绒毛膜滋养层细胞中,通过荧光定量PCR检测其干扰效率。结果显示,重组干扰质粒enJRSV-env-shRNA-1、enJRSV-env-shRNA-2、enJRSV-env-shRNA-3、enJRSV-env-shRNA-4、Negative-shRNA构建成功。Lipofectamine LTX脂质体体积为6.0μL,转染混合物体积为100μL,转染48h组的转染效率最高,为42.37%。与正常对照组细胞的enJSRV-env mRNA表达量相比,转染靶基因干扰质粒的各组绵羊绒毛膜滋养层细胞中enJSRV-env mRNA表达量分别下调了73.56%、66.82%、33.66%和18.16%。筛选出了一个干扰效率最高的RNA干扰质粒enJRSV-env-shR-NA-1,为以后包装慢病毒及进行动物试验来揭示enJSRV的生殖生物学作用奠定了坚实的基础。     

流感病毒感染的p53+/+小鼠和p53-/-小鼠肺组织中细胞凋亡相关基因表达变化的分析

用流感病毒PR8株感染8～10周龄p53+/+小鼠和p53-/-小鼠,分别在病毒感染后第3天和第6天采取小鼠肺组织,用基因芯片技术检测肺组织中细胞凋亡相关基因的表达水平,并对差异基因进行分析。结果显示,在病毒感染后第6天,p53+/+小鼠与p53-/-小鼠相比,促进细胞凋亡的基因表达明显上调,而抑制细胞凋亡的基因表达下调。比较caspase家族基因表达变化的结果显示,caspase 3和caspase 7的表达明显上调,而caspase 1和caspase 4的表达有所下调。此外,参与调控细胞凋亡的p53靶基因的表达也有明显的变化。研究结果表明,p53可能通过引起细胞凋亡而起到抗流感病毒的作用。     

犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及其真核表达

为构建犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒,并在真核细胞中表达,以重组质粒pVAX1-NcAMA1为模板,PCR扩增了NcAMA1基因,以此构建了pMD18T-NcAMA1重组克隆质粒;对该重组克隆质粒进行双酶切鉴定后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pCR259中。应用脂质体介导转染法将经PCR鉴定和酶切鉴定正确的pCR259-NcAMA1重组穿梭质粒转染293细胞,应用IFAT和Western-blot技术检测了AMA1基因在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的NcAMA1基因长度为1 695bp,构建的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1能在293细胞中获得瞬时表达,表达蛋白的分子质量约为68ku。     

慢病毒载体介导的西尼罗河病毒prME蛋白的表达

将西尼罗河病毒(WNV)的主要免疫原性基因prME插入HIV-1慢病毒载体pHR中,构建了转移质粒pHR-WNV/prME。在脂质体介导下,将该质粒与p△8.2、pVSV/G共转染293T细胞,48h后收获细胞上清。将上清转导正常的293T细胞,通过报告基因荧光观察、间接免疫荧光检测。结果表明,利用HIV-1慢病毒载体系统包装得到了假型病毒,可以高效转导293T细胞,并实现了WNVprME基因在被转导细胞中的表达,从而为基于慢病毒载体的WNV新型疫苗的研制奠定基础。     

旋毛虫Ts43基因真核表达载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

利用RT-PCR技术从黑龙江省猪源旋毛虫获得了Ts43基因,并克隆入pcDNA3.1-CT-GFP真核表达载体中构建重组质粒,用该重组质粒在脂质体介导下转染Vero E6细胞,GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,通过Western-blot分析,细胞裂解液样品中有1条约66 ku的条带,可被小鼠旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,说明,真核表达载体pcDNA3.1-CT-GFP中的Ts43基因在VeroE6细胞中获得了表达,表达产物具有抗原性。     

小反刍兽疫病毒H基因过表达对病毒增殖的影响

为研究小反刍兽疫病毒H基因过表达后对病毒增殖的影响,根据G en Bank中小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1 H基因序列,设计1对引物扩增H基因全长编码区序列,并将其连接至真核表达载体p EGF P-C 3上,经鉴定正确后转染CHS-20细胞,并通过R T-PCR、荧光观察及W estern-blot分别在m RNA和蛋白水平检测H基因的表达。结果表明,H基因在CHS-20细胞内得到了表达。将p EGFP-C3-PPRV H重组质粒、空载体p EGFP-C3转染CHS-20细胞,待H基因表达后,接种PPRV Nigeria 75/1,病毒增殖一定时间后,以β-actin作为内参基因,采用相对荧光定量RT-PCR法研究病毒增殖量的变化。结果表明,相对于未转染及转染空载体p EGFP-C3的细胞,转染p EGFP-C3-PPRV H重组质粒的细胞PPRV增殖量得到了提高,且差异显著(P0.05),这说明在CHS-20细胞中过表达PPRV H基因能促进PPRV增殖。     

日本血吸虫Wnt信号通路受体和配体真核表达载体的构建及表达

为了解日本血吸虫Wnt信号通路受体和配体间的相互作用关系,构建了日本血吸虫5个Wnt配体和4个Frizzled受体的真核表达载体,并转染293T细胞进行了表达。间接免疫荧光试验结果显示,所构建的p3×FLAG-Wnts、pRK5-frizzleds-myc真核表达载体均能在293T细胞中被成功表达。Western-blot结果显示,所表达的重组蛋白的分子质量与理论分子质量相符。双重间接免疫荧光试验结果显示,两组共转染受体和配体重组质粒p3×FLAG-Wnt2、p3×FLAG-Wnt4与pRK5-frizzled5-myc、pRK5-frizzled8-myc能够在同一细胞内共表达。本研究为下一步分析Wnt受体和配体间相互作用关系奠定了试验基础。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

猪霍乱沙门菌SC500运载TGEV S与猪IL-15融合基因疫苗的稳定性及免疫安全性

为研究猪霍乱沙门菌SC500作为TGEV S与IL-15融合基因疫苗pCC-S-IL-15、pCI-S-IL-15运载体的稳定性与免疫安全性,将外源表达质粒pCC-S-IL-15、pCI-S-IL-15及空载体质粒pCC-neo、pCI-neo转化SC500,采用体外增殖试验研究不同质粒在SC500中的稳定性,携带质粒的SC500对ST细胞的黏附率、侵袭力和增殖能力的影响;采用BALB/c小鼠口服免疫试验研究表达质粒在体内的稳定性及SC500对小鼠的安全性.结果显示:外源目的基因影响表达载体在运载体内的稳定性,就载体类型而言,对pCI-neo的影响大于对pCC-neo的影响;携带目的基因的外源质粒影响SC500对ST细胞的黏附率和侵袭率,pCC-neo影响大于pCI-neo;外源质粒影响SC500在小鼠体内的增殖能力,pCC-neo影响大于pCI-neo;SC500在体内的增殖中,其所运载的质粒具有一定的稳定性.结果表明,利用SC500运载基因疫苗pCC-S-IL-15、pCI-S-IL-15免疫小鼠具有相对的稳定性和免疫安全性.     

牛轮状病毒VP7基因在昆虫细胞中的表达

利用PCR方法扩增出牛轮状病毒外衣壳蛋白VP7基因,经BamHⅠ+PstⅠ特异性酶切后,连接于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA中,成功构建了重组质粒pFastBacHTA-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素筛选和PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-VP7。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,成功扩增了VP7基因,大小为981bp,所表达的重组蛋白大小为40.4ku,与预期值相符,该蛋白能与牛轮状病毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛轮状病毒ELISA检测试剂盒奠定了物质基础。     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达。提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体。     

LncRNA TCONS_00179042对Marc-145细胞中PRRSV复制的影响

应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_00179042全长序列;通过q PCR、TCID50测定和Westernblot分析该Lnc RNA对PRRSV GSWW15株复制的影响;通过核质分离试验对PAMs细胞中Lnc RNA TCONS_00179042进行定位和半定量分析。RT-PCR检测结果显示,Lnc RNA TCONS_00179042长度约为430 bp。pc DNA3.1-TCONS_00179042过表达载体转染Marc-145细胞后,q PCR结果显示:该Lnc RNA的相对表达量约是对照组的3×105倍,表明Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中过表达。利用PRRSV GSWW15株感染过表达Lnc RNA TCONS_00179042的Marc-145细胞后,q PCR结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV RNA拷贝数约为对照组的60%;TCID50检测结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV病毒滴度显著低于对照组,约为对照组的20%;Western-blot试验结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV N蛋白的表达量显著低于对照组。三组数据均显示,Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中抑制PRRSV GSWW15株的复制。核质分离试验结果显示,不论是细胞质还是细胞核均有Lnc RNA TCONS_00179042存在,且细胞核中的表达量大于细胞质中。本研究结果表明,该Lnc RNA能在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制,能作为一种抗病毒分子参与调控宿主的抗病毒反应。