禽致病性大肠杆菌sfsA基因缺失株的构建及生物学特性的分析

为研究sfs A基因对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,利用Red重组方法构建禽致病性大肠杆菌APEC94株的sfs A基因缺失株,分析野生株与缺失株在生长特性、黏附和入侵D F-1细胞及生物被膜形成等生物学特性上的差异。通过动物试验,评价sfs A在APEC感染樱桃谷鸭过程中的作用。结果表明,sfs A缺失不影响APEC94菌株的生长特性和黏附、入侵DF-1细胞能力,但缺失株的生物被膜形成能力明显下降(P0.000 1)。动物试验结果表明,与野生株相比,sfs A缺失株在樱桃谷鸭肝中的细菌载量显著降低(P0.05),而在肾、脾和血液中无显著下降(P0.05)。结果显示,sfs A基因的缺失显著降低禽致病性大肠杆菌的生物被膜形成能力及其在肝中的细菌载量,推测sfs A基因可能参与APEC对宿主的致病性。     

密度感应系统luxS基因对鼠伤寒沙门菌生物学特性及毒力的影响

通过构建鼠伤寒沙门菌luxS缺失株,研究其生物学特性及对Ⅵ型分泌系统(T6SS)的影响。利用Red同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌luxS缺失株,比较野生株、luxS缺失株的生长特性、运动性、生物被膜、致病性等生物学特性的差异。利用荧光定量PCR、Western-blot对luxS基因缺失株T6SShcp1、hcp2和clpV基因转录水平和蛋白表达水平进行检测。结果显示,LuxS对鼠伤寒沙门菌生长速度、生物被膜形成能力及细胞黏附侵袭能力均无明显影响,但导致其运动性显著增强、致病力下降3.2倍,且不能合成自诱导分子2。在对数生长期和平台期,luxS基因均不影响T6SS核心组分Hcp1、Hcp2和ClpV的转录和表达。本研究表明,luxS基因缺失导致鼠伤寒沙门菌运动能力增强及毒力降低,但其不能影响T6SS核心组分的转录及表达。     

单增李斯特菌TatD基因缺失菌株的生物学特性研究

为探究TatD基因缺失对单增李斯特菌生物学特性的影响,本研究对缺失菌株LM10403sΔTatD的生化特性、生长特性、生物被膜、环境适应性、黏附、侵袭、增殖、耐药性、溶血特性和毒力等生物学特性进行研究。结果显示,LM10403sΔTatD与亲本菌株LM10403s的生化特性和生长特性均无明显差异。LM10403sΔTatD保留了LM10403s对温度、H₂O₂和EtOH的适应性,并且对巨噬细胞Raw264.7的黏附、侵袭和增殖没有发生明显改变。但与LM10403s相比,LM10403sΔTatD对高温(54℃)、酸性和苯扎溴铵的耐受性以及对头孢曲松的耐药性和胞外分泌蛋白的溶血特性均有所降低,而生物被膜形成能力有所提升。LM10403sΔTatD腹腔注射感染6周龄小鼠的LD₅₀为2.58×10⁶CFU,毒力稍低于LM10403s。上述结果表明,TatD基因缺失对单增李斯特菌LM10403s的生物学特性整体无明显影响,部分环境适应性和溶血特性有所降低,而生物被膜形成有所增加,为进一步探究TatD在单增李...     

肠炎沙门菌sipA基因缺失株C50336ΔsipA的构建及鉴定

为研究sipA基因对肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)的生物学特性的影响,利用λ-Red同源重组系统构建肠炎沙门菌C50336的sipA基因缺失株,同时将sipA基因克隆至pBR322质粒,将回补质粒电转化至缺失株,成功构建了回补株。通过比较肠炎沙门菌野生株、缺失株以及回补株在生长特性、生化特性、遗传稳定性、对小鼠的半数致死量以及对Caco-2细胞的黏附侵袭能力的差异,发现肠炎沙门菌sipA基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与野生株及回补株相比,其生长特性和生化特性未发生明显改变,对8周龄小鼠的毒力没有显著变化,不影响细菌对Caco-2细胞的黏附能力,但对Caco-2细胞的侵袭能力明显下降。上述研究结果为进一步研究sipA基因在肠炎沙门菌感染过程中的功能奠定了基础。     

肠炎沙门菌sopE2基因缺失株的构建及其生物学活性的鉴定

为研究sopE 2基因对肠炎沙门菌(Salm onella enteritidis)的生物学特性的影响及其与sopE功能差异,本研究以λ-Red介导的同源重组法构建了肠炎沙门菌C50336ΔsopE 2缺失株,并构建了以p BR322质粒介导的sopE2基因回复株。测定了肠炎沙门菌野生株、sopE 2缺失株及其回复株的基本生物学特性,包括对人肠上皮细胞Caco-2 BBE及小鼠巨噬细胞RAW 264.7的黏附、侵袭能力及对小鼠的半数致死量。结果显示,肠炎沙门菌sopE 2基因缺失对其生长、生化特性无影响;肠炎沙门菌C50336对Caco-2 BBE细胞的黏附率约为20%,侵袭率约为10%,对RAW264.7细胞的黏附率约为55%,侵袭率约为20%,sopE 2基因缺失对肠炎沙门菌C50336黏附能力无影响,侵袭能力有所下降,但无统计学差异;肠炎沙门菌C50336对小鼠的半数致死量为5.0×105CF U,sopE 2基因缺失株及回复株对小鼠的半数致死量均为3.2×105 CFU,表明sopE 2基因缺失对肠炎沙门菌的毒力无显著影响。本研究为进一步探讨sopE 2基因在肠炎沙门菌感染过程中的功能奠定了基础。     

维氏气单胞菌TH0426株ndk基因缺失株的构建与生物学特性分析

为研究维氏气单胞菌ndk基因的功能,利用自杀性质粒pRE112通过同源重组的方法缺失ndk基因,然后对野生株和缺失株的生长能力、运动性、生物被膜形成能力及LD50等进行差异分析。经过PCR以及荧光定量PCR表达水平证明ndk基因缺失成功;生物学特性研究显示,缺失株的生长能力和泳动性均下降;生物被膜形成能力与野生株相比差异极显著(P0.001);与野生株相比,LD50升高了5.5倍,且差异极显著(P0.001)。由此可以推测,ndk基因与维氏气单胞菌的毒力及生物被膜形成密切相关。本研究结果为维氏气单胞菌致病机制的研究奠定了基础。     

维氏气单胞菌rpoN基因缺失株的构建及部分生物学特性分析

为了研究rpoN基因对维氏气单胞菌致病性的影响,采用同源重组的方法构建该基因缺失株。以该菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增rpoN基因的上、下游同源臂;以上、下游同源臂胶回收产物为模板,P1-1/P2-2为引物进行重叠PCR扩增相应目的片段,从而获得rpoN上下游同源臂连接片段;将获取的连接片段连接pRE112,将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取重组质粒pRE112-rpoN,经同源重组和抗生素筛选获得维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN。同时,依然利用重叠PCR将目的基因片段与启动子相连接,而后与质粒p BBR-MCS相连接,最后将重组质粒pBBR-MCS-rpoN转化至缺失株ΔrpoN中,构建互补株C-rpoN。PCR鉴定和测序结果显示,成功构建出维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN和互补株C-rpoN。生物学特性分析试验结果表明rpoN的缺失导致维氏气单胞菌TH0426菌落形态改变、生物被膜形成能力下降、动物致病性减弱,鞭毛断裂,运动性丧失。本研究中成功构建了维氏气单胞菌TH0426株rpoN基因的缺失株ΔrpoN,为进一步研究维氏气单胞菌减毒疫苗和rpoN基因的功能奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌crp基因缺失株SL1344Δcrp生物学特性的测定

为研究crp基因缺失后引起的减毒机制,本试验对鼠伤寒沙门菌crp基因缺失株SL1344Δcrp的有关生物学特性进行了测定。结果显示,与亲本菌株相比,缺失株失去了运动能力;SL1344Δcrp不表达纤维素和菌毛,不能形成生物被膜;SL1344Δcrp对细胞增殖和细胞毒性的影响均弱于亲本菌株;crp基因缺失后缺失株对上皮细胞的黏附和侵入能力与亲本菌株相比无明显差异。上述结果表明,crp基因不仅是重要的毒力基因,还是生物被膜形成的调控基因;这些结果为深入研制以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定了基础。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp/LppB双基因缺失株的构建与验证

在维氏气单胞菌单基因缺失株ΔLpp的基础上,通过同源重组方法获得脂蛋白LppB基因上、下游同源臂连接片段,依次构建重组克隆载体pMD18-T-L-UD1225和重组自杀性载体Pre112-L-UD1225,随后转入WM3064感受态细胞中作为供体菌,与受体菌ΔLpp进行结合转移,构建双基因缺失株ΔLpp/LppB,通过反转录验证并检测其遗传稳定性。结果显示,成功构建了遗传稳定性良好的双基因缺失株ΔLpp/LppB,其生长速率和生物被膜形成能力较野生株WT均下降。结果表明,协同缺失脂蛋白基因Lpp和LppB后,双基因缺失株ΔLpp/LppB的生长和生物被膜变化更显著,这有利于进一步推测脂蛋白基因的功能,为之后研究维氏气单胞菌的致病机制奠定了基础。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp/LppB双基因缺失株的构建与验证

在维氏气单胞菌单基因缺失株ΔLpp的基础上，通过同源重组方法获得脂蛋白LppB基因上、下游同源臂连接片段，依次构建重组克隆载体pMD 18-T-L-UD1225和重组自杀性载体Pre112-L-UD1225，随后转入WM3064感受态细胞中作为供体菌，与受体菌ΔLpp进行结合转移，构建双基因缺失株ΔLpp/LppB，通过反转录验证并检测其遗传稳定性。结果显示，成功构建了遗传稳定性良好的双基因缺失株ΔLpp/LppB，其生长速率和生物被膜形成能力较野生株WT均下降。结果表明，协同缺失脂蛋白基因Lpp和LppB后，双基因缺失株ΔLpp/LppB的生长和生物被膜变化更显著，这有利于进一步推测脂蛋白基因的功能，为之后研究维氏气单胞菌的致病机制奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌yibT基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了探讨yibT基因对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响,采用λ-red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌CVCC541的yibT基因缺失株CVCC541ΔyibT,同时利用表达质粒pET28a构建yibT缺失株的基因回补株CVCC541ΔyibT/pyibT,研究野生株、缺失株、回补株之间的生长特性、生化特性、遗传稳定性、生物膜形成和应激环境抵抗力等生物学特性。结果表明,本研究成功构建了yibT基因缺失株CVCC541ΔyibT及其回补株CVCC541ΔyibT/pyibT,yibT基因的缺失不影响细菌的生化特性,该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其生长特性较野生株及其回补株显著减缓,生物膜形成能力相较于野生株及其回补株有所减弱,缺失株在热应激环境以及正丁醇压力下表现出更强的耐受力。综上所述,yibT基因的缺失会影响鼠伤寒沙门菌的生长特性、生物膜形成、应激环境抵抗力和细菌形态等生物学特性,并且yibT基因可能影响鼠伤寒沙门菌菌膜的流动性。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp基因缺失株的构建及其部分生物学特性分析

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的致病机制,在全基因测序的基础上,通过同源重组缺失脂蛋白基因。首先扩增脂蛋白基因的上下游同源臂,通过重叠PCR连接后,凝胶回收DNA片段;连接克隆载体pMD18-T,转化DH5α感受态细胞,测序成功后提取质粒进行双酶切,连入相同酶切的Pre112自杀性质粒;依次转化DH5α-λpir、WM3064感受态细胞,作为供体菌;和受体菌野生株进行同源重组,并筛选鉴定。结果显示,成功缺失了维氏气单胞菌脂蛋白基因。生物学特性分析结果发现,缺失株和野生株的生长速度相似,生物膜形成能力降低,鞭毛缺失,游动能力减弱,细菌的毒力降低,溶血活性没有明显变化。因此,成功构建了维氏气单胞菌脂蛋白基因缺失株,并分析了其部分生物学特性,为进一步研究脂蛋白基因的功能奠定了一定的基础。     

2型猪链球菌动物致病性试验

用5株2型猪链球茵对BALB/c小鼠、猪、兔和普通小白鼠进行攻毒试验,其中SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠有致病性,其LD50分别为2.1×106、3.1×107、5.3×10 7、9.4×107,SS2-N株以2.8×108对BALB/c小鼠不致死.SS2-1株对猪有致病性,LD50为4.2×107,ID50为1.33×106,而以8×108活菌攻击对兔和普通小白鼠均未致病.表明2型猪链球茵可人工感染BALB/c小鼠和猪引起发病,2型猪链球菌MRP和EF毒力因子的表现型与其对BALB/c小鼠的致病性无相关关系,BALB/c小鼠可用作疫苗免疫试验的动物模型.     

鉴别禽致病性大肠杆菌与禽非致病性大肠杆菌的多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴别禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)与禽非致病性大肠杆菌(avian non-pathogenic Escherichia coli,ANPEC)的多重PCR检测方法,本研究针对APEC的iss、cvaC、irp2、iucD、iroN和tsh共6个毒力基因的序列进行分析,分别设计合成6对特异性引物,通过正交组合法优化引物比例和梯度法确定最佳退火温度,并进一步完善方法的敏感性、特异性和判定标准,建立了一种快速灵敏检测APEC的多重PCR检测方法,并初步应用该方法对本实验室102株大肠杆菌样本进行鉴定和分群。结果显示,该多重PCR方法对菌液最低检测浓度为5×107CFU/m L;对其他种属的4株革兰阳性菌和5株革兰阴性菌无扩增。检测实验室保存的鸭源APEC和ANPEC各10株,通过比较两者所含毒力基因的分布情况及数量,建立了多重PCR判定标准即所含毒力基因数大于等于3者为APEC阳性菌株。初步应用该方法检测实验室分离保存的23株APEC和79株ANPEC,同时进一步验证了其准确性。结果表明,APEC检出率为100%,ANPEC的检出率亦为100%。以上结果充分说明本研究建立的多重PCR特异性强、灵敏度高、简便快捷,可进一步应用于禽类的APEC与ANPEC的快速鉴别诊断和APEC的分子流行病学调查。     

猪链球菌2型动物致病性试验研究

选取猪链球菌2型SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7和SS2-N(国外引进)株,对BALB/c小鼠、猪、兔及普通小白鼠致病性进行试验.结果SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠半数致死量(LD50)分别为2.1×106、3.1×107、5.3×107和9.4×107,SS2-N株以2.8×108活菌对BALB/c小鼠不能致病;SS2-1株对猪LD50为4.2×107,对猪半数感染量(ID50)为1.33×106,用8.0×108活菌对兔及普通小白鼠感染均不能致病.提示猪链球菌2型人工感染可引起BALB/c小鼠和猪发病;其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)和细胞外因子(EF)的表现型与对BALB/c小鼠的致病性无相关关系;BALB/c小鼠可用于猪链球菌(2型)病疫苗免疫试验的动物模型.     

表达IBDV VP2蛋白的重组弱毒肠炎沙门菌的构建及其免疫原性的初步研究

为研究肠炎沙门菌rfaH基因与致病性的关系及肠炎沙门菌rfaH基因缺失株作为疫苗载体的可行性,进一步探索传染性法氏囊病(IBD)的防控路径,通过λ-Red同源重组的方法构建了缺失rfaH基因的肠炎沙门菌(rSD),再以其为亲本菌株构建了稳定表达IBDV VP2蛋白的重组肠炎沙门菌(Se-VP2)。以1日龄SPF雏鸡为实验动物,分别检测了重组菌的致病力及免疫效果。结果显示,rSD株和Se-VP2株与野生株生长速度一致,体外连续传20代,基因缺失株和重组株均可稳定遗传;Western-blot表明,Se-VP2株可稳定表达VP2蛋白;构建的重组菌rSD株和Se-VP2株对SPF雏鸡无致病性,半数致死量(LD50)大于1.0×1010CFU,且重组菌Se-VP2株免疫动物后可同时诱导产生针对IBDV和沙门菌的抗体;重组菌Se-VP2株可以诱导T淋巴细胞产生Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4,并能刺激外周血淋巴细胞的增殖分化;攻毒保护性试验结果显示,Se-VP2株免疫动物后可对IBDV和沙门菌的感染提供100%的保护。结果表明,rfaH基因是沙门菌的毒力基因,重组弱毒肠炎沙门菌Se-VP2株作为疫苗候选株,对SPF雏鸡安全有效,为后续肠炎沙门菌作为表达载体的研究奠定了基础。     

猪链球菌9型国内分离株毒力基因的检测及小鼠免疫试验

通过检测7株猪链球菌9型(SS9)国内分离株的毒力基因,比对7株SS9荚膜合成基因cps9j的300 bp碱基序列,以及进行7株SS9对小鼠的毒力试验和免疫保护试验,初步探讨了国内SS9的毒力特性.结果显示,7株SS9均缺失胞外因子(epf)和溶血素(sly)基因,溶茵酶释放蛋白基因(mrp)存在于GZ0665和GD0606株,orf2仅存于GZ0665株;病猪脑脊液分离株GZ0665与从健康猪扁桃体分离的6株SS9的cps9j同源性低;在7株SS9分离株和SS2分离株HA9801中,只有GZ0665和GD0606株能致死小鼠;用灭活的GZ0665菌株免疫的小鼠对同源菌株GZ0665及GD0606株攻击的保护率均为100%(10/10),用灭活的GD0606和未灭活的GD0627菌株免疫的小鼠对GD0606株攻击的保护率分别为80%(8/10)和50%(5/10),而对GZ0665株攻击的保护率分别为60%(6/10)和30%(3/10).证实,SS9病猪脑脊液分离株的毒力基因有剐于SS9健康猪扁桃体分离株和SS2.表明,小鼠可以用来区分SS9病猪脑脊液分离株与健康猪扁桃体分离株的致病力.     

鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为研究sifA基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的sifA基因缺失株S06004ΔsifA,同时构建该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA),并对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性进行了研究。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了sifA基因缺失株S06004ΔsifA和该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA);生物学特性研究结果显示,sifA基因的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其对3日龄雏鸡的LD50升高了39.3倍。本研究获得的减毒鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株S06004ΔsifA为进一步研究鸡白痢沙门菌sifA基因的功能奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为了探究5'-nucleotidase基因的功能及其在鼠伤寒沙门菌感染中的作用,本研究首先构建缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因的重组自杀性质粒pR E 112Δ5'-nucleotidase,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344Δ5'-nucleotidase缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。PCR及测序结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase构建成功,且回复株SL1344CΔ5'-nucleotidase构建成功。进一步研究表明,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因,生长速度没有发生明显改变。但是,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为4.30×10~7CF U,毒力降低至亲本株SL1344的1.96%。免疫保护率试验结果显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。缺失株免疫小鼠后第21天,血清抗体IgG水平达到最高。回复菌株与亲本亲株之间生物学特性无显著性差异,基本恢复到野生型水平。上述结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因与其致病力之间的关系提供了依据,并为研究它在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定了基础。     

鸭源致病性大肠杆菌的分离鉴定及系统发育分析

为确定江苏省徐州市某养鸭场病死鸭的病原菌,从发病鸭的肝中分离到1株细菌并命名为JSE 4,根据形态特征、培养特性、生化试验、16S r R N A分子鉴定结果可确定该菌为大肠杆菌(E.coli)。对该分离菌进行致病型快速鉴定、动物致病试验、毒力基因检测、药敏试验、系统发育分析,结果显示,该分离株为禽致病性大肠杆菌(APEC),可引起试验组SPF雏鸭死亡,死亡率为16.7%。分离株含有14种毒力基因中的12种,29种常用抗菌药物中,该分离株仅对链霉素、呋喃妥因、亚胺培南、呋喃唑酮、头孢他啶、氨曲南这6种药物具有敏感性。该分离株与源自比利时水源、瑞士禽肉源和中国鸭源分离株的亲缘关系最近,与比利时水源、瑞士禽肉源分离株的同源性高达99.7%。研究表明,从江苏徐州周边养鸭场病死鸭中分离到1株多重耐药的禽致病性大肠杆菌。