家兔须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立家兔须癣毛癣菌快速检测方法,根据GenBank上已发表的须癣毛癣菌rDNA内转录间隔区核苷酸序列设计了1对特异性引物,建立了检测须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床分离的须癣毛癣菌和病料进行检测。结果显示,该方法灵敏度高,对须癣毛癣菌的最低检出量为10copies/μL;特异性强,与犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉等病原真菌没有交叉反应。该方法操作简单,耗时短,只需2h即可完成整个试验过程。提示该方法可用于须癣毛癣菌的检测。     

家兔皮肤真菌双重SYBR GreenⅠ定量PCR检测方法的建立

为建立家兔皮肤真菌快速检测方法,根据GenBank相关基因,分别设计皮肤真菌和须癣毛癣菌这2对特异引物,建立了皮肤真菌和须癣毛癣菌双重SYBR GreenⅠ定量PCR方法。结果显示,在熔解温度86~86.5℃和88.5~89℃分别出现皮肤真菌和须癣毛癣菌特异波峰,且与其他真菌没有交叉反应;重复试验变异系数为0~0.32%;最低检测浓度为3.3×10/mL;分离菌株样本与病料样本双重SYBR GreenⅠ定量PCR检测结果一致。结果表明,本试验建立的双重SYBR GreenⅠ定量PCR方法特异、稳定、敏感,可以用于临床样品的检测。     

1株抗须癣毛癣菌枯草芽孢菌的鉴定

为了探讨抗须癣毛癣菌感染新的治疗途径,从患须癣毛癣菌病兔自然恢复皮肤分离了1株细菌,经16S rDNA基因比对,并结合菌落形态进行了鉴定,通过体内外试验测定其对须癣毛癣菌的拮抗作用。结果显示,分离株能在营养琼脂培养基生长,菌落为皱褶圆形,菌体呈杆状,革兰染色阳性,基因序列分析与GenBank中的枯草芽孢杆菌相似率为99.8%,该分离株被鉴定为枯草芽孢杆菌。抗菌谱分析显示,分离株对须癣毛癣菌能形成抑菌圈,对白色念珠菌、平滑念珠菌、热带念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌没有抑制作用。该分离株与须癣毛癣菌混合培养,能明显抑制须癣毛癣菌生长。在皮肤涂抹试验中,该分离株能逆转由须癣毛癣菌引起的皮肤病变。本试验证实了分离的枯草芽孢杆菌对须癣毛癣菌有明显的拮抗作用。     

家兔须毛癣菌感染模型的构建

为了建立须癣毛癣菌感染家兔模型,对临床分离的须癣毛癣菌进行基因分型,选用Ⅰ型菌制成孢子悬液,直接涂抹剪毛后的家兔皮肤,观察皮肤大体和显微结构病变情况。结果发现,皮肤涂抹孢子悬液后,大体病变皮肤潮红、皮屑增多,有渗出,形成结痂;显微镜下,皮肤充血,角质层增厚,炎性细胞浸润,局部形成脓肿;皮肤组织进行特殊染色,在毛囊或毛干内有大量菌丝;从病变皮屑中分离鉴定出须癣毛癣菌。上述结果提示,本试验成功建立了须毛癣菌感染家兔模型。     

致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种快速鉴别检测致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA和白细胞毒素(lktA)基因保守序列设计特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了鉴别致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法与其他24种常见牛羊细菌均无交叉反应,具有较好的特异性;其检测lktA基因阳性和阴性溶血性曼氏杆菌的最低检出限度均为40 copies,具有较好的敏感性。应用建立的双重荧光定量PCR方法和普通PCR方法对48份临床样品进行检测,这2种方法检出的溶血性曼氏杆菌阳性率分别为27.1%和18.8%,检出lktA基因阳性溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为20.8%和12.5%,阳性符合率为100%。本研究中建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊溶血性曼氏杆菌致病性与非致病性菌株感染的高通量快速鉴别诊断提供了可行手段。     

O157:H7型大肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的肠出血性大肠杆菌保守基因序列Stx1、Stx2设计合成荧光定量PCR引物和探针,对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床分离病料进行了检测,并与常规PCR方法的检测结果做了对比.结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的灵敏度达7.06×103CFU/mL,比常规PCR方法的灵敏度高106倍.用该方法和常规PCR对8种样品进行了检测,证实,该方法与常规PCR的阳性符合率为100%,具有较好的重复性.     

山羊支原体山羊肺炎亚种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp),选择Mccp arc D基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立并优化反应体系,以Mccp和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为模板,进行普通PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR特异性检测,并对该方法的敏感性和重复性进行评估。同时利用该方法对68份山羊临床样本进行检测。结果显示,仅Mccp有扩增条带(185 bp)和明显的荧光扩增信号(Ct值为21.93),其余供试菌株没有扩增条带,且表现出微弱的荧光扩增信号(Ct值均大于31)。普通PCR检测的灵敏度为5.96×104copies/L,而TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的灵敏度为5.96 copies/L。Ct值在组内和组间重复的变异系数均小于1%。对68份山羊临床样本进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测,结果有2份为Mccp阳性样本,阳性率为2.94%。本研究建立了一种特异、敏感、稳定可靠的Mccp TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可用于Mccp的快速诊断和定量检测,为山羊传染性胸膜肺炎的防控提供了有效的技术手段。     

四种中药乙醇提取物对常见皮肤癣菌的体外抗菌活性

采用冷凝回流提取方法和参照M38-A液体微量稀释法,对苦参、白鲜皮、土茯苓、土荆皮4种中药的乙醇提取得率及其乙醇提取物的抗真菌活性进行了研究。结果显示,苦参、白鲜皮、土茯苓和土荆皮的乙醇提取得率分别为19.54%、10.60%、14.12%和26.05%。苦参、白鲜皮、土茯苓和土荆皮的乙醇提取物对石膏小孢子菌的MIC值分别为0.7813、3.125、100和3.125mg/mL;对须癣毛癣菌的MIC值分别为0.781、3.125、50和0.781mg/mL;对犬小孢子菌的MIC值分别为3.125、1.563、25和0.781mg/mL。这4种提取物对石膏小孢子菌的MFC值分别为1.563、6.25、100和6.25mg/mL;对须癣毛癣菌的MFC值分别为3.125、6.25、100和1.563mg/mL;对犬小孢子菌的MFC值分别为6.25、3.125、50和1.563mg/mL。结果表明,土茯苓乙醇提取物具有较差的抑菌、杀菌作用,苦参、白鲜皮和土荆皮的乙醇提取物具有明显的抑菌、杀菌作用。     

皮癣菌和皮癣菌病

(一)皮癣菌 皮癣菌是由具有嗜角化组织的一类独特的丝状真菌所构成。根据其形态学、生理学特征和营养需要,将皮癣菌分成3个属,即毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属,共有40个种。其中毛癣菌属含有25个种,小孢子菌含14个种,表皮癣菌1个种。直至最近,这些真菌还分类在不完全菌纲,那就是说没有性状态。然而,在某些毛癣菌种和小孢子菌种中已发现有子实体(子囊孢子)产生的有性状态,因     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种灵敏、特异、快速地检测食品中致病性沙门菌的方法,针对沙门菌致病性菌株特有的invA基因设计引物,PCR扩增目的片段,构建重组质粒pMD19-T-inv285,将其作为标准品进行real-time PCR反应体系的优化和标准曲线的绘制,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测;同时用该方法对90份肉品样品进行检测。结果显示,建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程为y=-3.397 1 x+27.313,相关系数r2=0.999 6。该方法的灵敏度为5×100copies/μL,是普通PCR(5×102 copies/μL)的100倍。对10种常见食源性细菌的检测结果均为阴性;组内和组间重复试验的变异系数均低于1%。对90份肉品样品的检出率(6/90,6.67%)显著高于快速MALDI-TOF-MS法和传统的细菌分离鉴定方法(均为3/90,3.33%)。结果表明,本试验建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于食品中致病性沙门菌的快速检测。     

霍乱弧菌三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种基于TaqMan探针法定量检测霍乱弧菌的三重荧光定量PCR方法,以霍乱弧菌种特异性基因ompW和毒力基因ctx、hly为靶基因,分别设计特异性引物及相应的TaqMan探针。在ompW、ctx、hly探针的5'端分别标记CY5、FAM、HEX荧光报告基团,3'端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示,本试验建立的三重荧光定量PCR方法与其他菌株无交叉反应,其最低检出限达到了10 CFU/m L,重复性试验中每组变异系数均小于1.4%;检测人工染菌的虾肉和贝类样品时,最低检出限也达到1×102CFU/m L。结果表明,本实验室建立的三重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,是高通量检测致病性霍乱弧菌的有效手段。     

溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、准确检测猪溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,优化反应条件,建立了检测溶血性曼氏杆菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,以重组质粒pMD-MH-16S为标准品建立的标准曲线在3.06×10~8~3.06×10~1copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到3.06×101 copies/L的标准品阳性质粒。该方法与其他24种常见细菌均无交叉反应,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的方法和普通PCR方法对65份临床样品进行检测,阳性率分别为56.92%和21.54%,阳性符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于牛、羊溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。     

犬细小病毒的新型原液荧光定量PCR方法的建立

为建立一种不提取病毒DNA,直接采用样本上清液检测犬细小病毒(CPV)的TaqMan荧光定量PCR方法,通过扩增CPV NS基因部分片段构建重组质粒,建立TaqMan荧光定量PCR方法;对建立的方法进行反应条件、特异性、敏感性的检测;通过建立的方法对核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR进行对比;最后对临床中疑似的CPV病例进行检测。结果显示,建立的方法特异性好,对犬常见病毒无扩增。该方法检测的灵敏度达101copies/L,该方法的批内变异系数为0.09%~1.30%,批间变异系数为0.57%~0.94%,重复性良好。核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR的最低检测浓度均可以达到101 copies/L,且原液荧光定量PCR的产物浓度约为核酸荧光定量PCR的7倍,提示核酸在提取过程中有大量的损耗。对187份临床病料进行检测,建立的方法共检出128份阳性,与普通PCR和胶体金快速检测板的阳性符合率均为100%,核酸法与原液法的符合率为100%。因此,本试验建立的CPV病料原液TaqMan荧光定量PCR方法与普通PCR和胶体金快速检测板相比,具有阳性检出率更高、准确率更好的特点。     

我国十省份羊巴贝斯虫的分子流行病学调查

为了调查和分析羊的巴贝斯虫(莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种)在我国的分布情况,2010—2014年间,于我国10个省份共采集到823份绵羊和山羊血液样本,应用区分莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种的实时荧光定量PCR方法,对提取的基因组DNA进行了检测。结果显示,除了海南省,其他省份都检测到莫氏巴贝斯虫的感染,总体阳性率为5.95%(49/823),其中河南省的阳性率最高,为10.47%(9/86);而羊巴贝斯虫未定种只在湖北、贵州和甘肃省检测到,阳性率分别为4.55%(2/44)、6.38%(3/47)和0.62%(2/322)。本研究首次应用实时荧光定量PCR对我国羊巴贝斯虫病的流行状况进行大范围的调查,为进一步了解我国羊巴贝斯虫的分布情况和制定羊巴贝斯虫病防控策略提供了可靠的分子流行病学信息。     

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR,针对坦布苏病毒E基因设计1对特异性引物,用PCR扩增E基因后将其连接到pMD19-T载体上构建重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板绘制了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,经反应条件优化后,绘制的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR的标准曲线的线性关系显著(r20.999),平均试验间变异系数为0.26%;检测敏感性可达到2×101 copies/μL。应用该方法对人工感染坦布苏病毒的鸭组织进行的检测结果显示,从36份病料组织中检出35份为阳性,检出率为97%。结果表明,成功建立了检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR,该方法较常规PCR更快捷、敏感、准确,适用于坦布苏病毒临床样品的检测。     

卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种检测感染牛的卵形巴贝斯虫的敏感、快速方法,本研究根据GenBank中登录的卵形巴贝斯虫18S rRNA保守区设计1对特异引物,通过优化反应条件,建立了检测卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异地检测出卵形巴贝斯虫DNA,对瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫DNA的检测均为阴性;该方法的灵敏度可达1.26 copies/μL,比普通PCR灵敏度高100倍。组内及组间重复试验的变异系数均小于3%。对60份临床牛血液DNA样本进行检测,荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为41.67%和33.33%。结果表明,本试验建立的荧光定量PCR方法可用于对卵形巴贝斯虫定量分析和卵形巴贝斯虫病的分子流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。     

副溶血性弧菌LUXTM荧光PCR快速检测方法的建立

根据LUXTM荧光PCR技术原理,针对副溶血性弧菌toxR基因的保守序列,设计了特异的LUXTM荧光标记引物,通过优化反应条件与参数,建立了可快速检测副溶血性弧菌的LUXTM荧光PCR方法。结果显示,该方法高度敏感,对纯菌的检测低限达到每个反应体系7个菌(CFU),经6 h增菌培养后检测,对样品的检测低限(CFU)达到100/25 g;特异性强,对副溶血性弧菌2株标准菌株和10株参考菌株的检验均呈阳性,而对霍乱弧菌等28株非目标菌的检测均呈阴性;重复性好,定量检测的批内和批间变异系数均小于1%。应用此方法检测水产样品103份,检出阳性样品6份,与TaqMan荧光PCR和SN标准的检测结果完全一致。用此方法可在8 h内完成对样品中副溶血性弧菌的检测,其检测的快速性、敏感性和特异性与TaqMan荧光PCR技术相当,但检测成本更低。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测大熊猫轮状病毒的比较研究

为确定一种准确快速检测大熊猫轮状病毒的方法,同时监测大熊猫轮状病毒的感染情况,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR检测2011至2015年(除2014年)大熊猫基地A和B共227份大熊猫粪便中的轮状病毒。结果显示,利用荧光定量RT-PCR方法检测出25份阳性粪便样品,阳性率为11%(25/227);利用常规RT-PCR检出15份阳性粪便,阳性率为6.6%(15/227),表明荧光定量RT-PCR更适用于大熊猫轮状病毒的检测。在大熊猫基地A,2011—2013年未检出轮状病毒阳性样品,而2015年6月检出10份阳性样品,阳性率为13.5%(10/74),表明该基地的轮状病毒未被净化;在大熊猫基地B,2011—2013年平均阳性率为19%(12/63),2015年阳性率降至12%(3/25),表明近年轮状病毒在大熊猫中带毒情况逐年缓解。