小鼠Ghrelin基因真核表达质粒的构建及对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

为构建小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒,并研究Ghrelin对3T3-L1细胞增殖的影响,以小鼠肠cDNA为模板,通过PCR扩增Ghrelin基因,插入到pMD18-T克隆载体中。对经鉴定的重组质粒pMD-Ghrelin进行双酶切,将目的基因连接到经同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用Lipofectamine 3000转染试剂将重组表达质粒转染到3T3-L1细胞中,采用qRT-PCR和Real-time PCR检测Ghrelin基因在3T3-L1细胞中的表达。采用CCK-8法检测细胞的生长活力;流式细胞术检测Ghrelin基因对细胞周期和凋亡的影响;采用Real-time PCR检测部分周期相关基因的mRNA表达水平。结果显示,成功构建了小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Ghrelin,并能在3T3-L1细胞中得到很好地表达,其表达倍数是空质粒组的5倍(P0.01);转染后第48、72和96小时,Ghrelin转染组3T3-L1细胞的生长活力明显高于空载体组(P0.05或0.01);转染后第24小时,Ghrelin转染组S期细胞数量明显高于空载体组(P0.05);Ghrelin过表达对3T3-L1细胞的凋亡无明显影响(P0.05)。qRT-PCR结果显示,Ghrelin转染组细胞的c-myc(P0.05)、E2F1、CDK2(P0.05)等mRNA的表达量也明显高于空载体组,P53表达低于空载体组,差异显著(P0.05)。以上结果表明,Ghrelin过表达能显著促进3T3-L1细胞的增殖,但不影响凋亡。     

胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化的影响

对分离自20日龄雄性SD大鼠附睾和肾周白色脂肪组织的前体脂肪细胞进行原代培养,并采用MTT比色法、油红O染色提取法分析了100~400 nmol/L胰岛素对其增殖、分化的影响,同时利用半定量RT-PCR分析了该浓度胰岛素对分化标志基因———脂肪酸合酶(FAS)、乙酰CoA羧化酶α(ACC1)基因mRNA表达的影响。结果显示,胰岛素能有效地促进前体脂肪细胞的增殖和分化(P<0.05),在400 nmol/L以下具有剂量依赖性;胰岛素处理72 h能显著提高脂肪细胞FAS和ACC1基因mRNA的表达水平(P<0.05)。证实胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化有明显促进作用。     

葛根素通过激活p38 MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖的研究

为研究葛根素(PUE)对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)的作用及其所关联的信号通路。通过培养MC3T3-E1细胞,运用CCK-8法对比加入不同浓度葛根素后细胞的增殖能力;通过CCK-8法检测最适浓度葛根素在不同时间对细胞增殖的影响;通过pNPP法测定碱性磷酸酶(ALP)的活性以检测不同浓度葛根素对细胞分化的影响;通过向p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated proteinkinase,p38 MAPK)信号通路中加入p38抑制剂SB203580分析细胞分化水平;通过蛋白质免疫印迹技术检测p38磷酸化蛋白(P-p38)表达水平;通过ELISA检测Ⅰ型胶原分泌水平。结果显示,不同浓度葛根素作用于MC3T3-E1细胞,可以不同程度促进细胞的增殖和分化,其中浓度为1×10~(-6)mol/L葛根素组的促进作用显著高于其他组。最适浓度葛根素在不同时间对细胞增殖作用有明显差异,其中48 h对细胞增殖作用最为显著。葛根素可以激活ALP,促进Ⅰ型胶原分泌,诱导细胞的分化。使用抑制剂SB203580阻断p38 MAPK信号通路后,相比于对照组,细胞增殖、ALP活力以及P-p38蛋白的表达水平明显降低。结果表明,葛根素可以通过激活p38 MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖和分化。     

乳香提取物对NIH-3T3细胞增殖及ERK1/2信号通路蛋白表达的影响

为研究乳香提取物对NIH-3T3细胞的增殖、细胞周期和ERK1/2蛋白表达及p-ERK1/2蛋白表达的影响,将NIH-3T3细胞传代后,随机分为药物干预组和空白对照组。在药物干预组向NIH-3T3细胞中加入不同浓度的乳香提取物并培养24h,利用CCK-8法检测细胞的增殖率,利用流式细胞术检测细胞周期比例,利用Western-blot检测ERK1/2蛋白及p-ERK1/2蛋白的表达。结果,分别用4×10-1 g/L和8×10-2 g/L乳香提取物干预细胞24h,吸光度较对照组差异极显著(P0.01)。用流式细胞术检测细胞周期,乳香提取物质量浓度为4×10-1 g/L、8×10-2 g/L和1.6×10-2 g/L时,S期比例较对照组差异极显著(P0.01),且随着乳香提取物质量浓度的降低,细胞周期中S期百分比降低,呈现出剂量依赖性。Western-blot结果显示,ERK1/2蛋白与对照组相比没有发生明显变化;但p-ERK1/2与对照组相比,随着乳香提取物的质量浓度升高,p-ERK1/2增高,且呈剂量依赖性。结果表明,乳香提取物通过激活ERK1/2信号通路促进NIH-3T3细胞的增殖。     

沙冬青生物碱对MDCC-MSB1细胞增殖抑制与诱导凋亡的影响

采用体外细胞培养技术、噻唑蓝(MTT)还原法、透射电子显微镜观察及流式细胞技术检测梯度浓度沙冬青总生物碱对体外培养鸡马立克氏病肿瘤HDCC-MSB1细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用。结果显示,沙冬青生物碱可显著抑制HDCC-MSB1细胞增殖,且这种抑制具有剂量和时间效应关系。经沙冬青生物碱作用的HDCC-MSB1细胞培养样本中有明显的DNA低含量颗粒(亚G1期峰),细胞周期各时相分布发生改变,细胞增殖在G1被阻滞,并进一步诱导HDCC-MSB1细胞凋亡。电子显微镜观察也表明,经沙冬青生物碱作用的HDCC-MSB1细胞培养样本中,大量HDCC-MSB1细胞凋亡。结果表明,沙冬青生物碱对HDCC-MSB1细胞增殖有显著抑制效应,其抑制机理为诱导HDCC-MSB1细胞凋亡。     

米糠多糖对环磷酰胺诱导免疫抑制鸡外周血T淋巴细胞增殖活性及疫苗免疫效果的影响

为探讨米糠多糖(RBS)对鸡免疫抑制状态的调节作用,将100只7日龄健康蛋用公雏鸡随机分为对照组、环磷酰胺(CTX)组和CTX RBS低、中、高3个剂量组。从7日龄起,肌肉注射CTX,1日1次,连注3 d,从10日龄起,CTX RBS组灌服RBS,1日1次,连续5 d。14日龄时各组鸡进行新城疫疫苗免疫。在10,21,28,35日龄,测定外周血T淋巴细胞增殖反应活性和ND HI抗体效价。结果显示,CTX组鸡的外周血T淋巴细胞增殖活性和ND HI抗体效价均显著低于对照组(P<0.01);CTX RBS中、高剂量组鸡外周血T淋巴细胞的增殖活性均显著高于CTX组(P<0.05或P<0.01),但低于对照组(P<0.05或P<0.01);CTX RBS中、高剂量组鸡的血清ND抗体效价均显著高于CTX组(P<0.05或P<0.01),且与对照组差异不显著(P>0.05)。证实,肌肉注射CTX可使健康雏鸡外周血T淋巴细胞的增殖反应活性和NDHI抗体效价显著降低,导致受试鸡免疫抑制;雏鸡口服一定剂量的RBS对CTX引起的细胞免疫和体液免疫抑制具有一定的拮抗作用。     

REV感染对SPF雏鸡胸腺细胞增殖和细胞周期及周期素D1的影响

为了探索禽网状内皮组织增生病病毒(REV)感染SPF雏鸡后,对其胸腺细胞增殖、细胞周期分布以及Cyclin D1的影响,将66只1日龄SPF雏鸡随机分为REV感染组和对照组,使用Cell counting Kit-8、流式细胞术、Western-blot、荧光定量PCR等方法对雏鸡胸腺细胞增殖、细胞周期及Cyclin D1 mRNA和蛋白的动态变化进行检测。结果发现,REV感染SPF雏鸡后,其胸腺细胞的增殖能力于第14、21、28天明显低于对照雏鸡;G0/G1期细胞数于第14天较对照雏鸡明显(P0.05)升高,S、G2/M期细胞数量减少,第28天时相反;Cyclin D1 mRNA表达于第14天极显著(P0.01)低于对照雏鸡,第35天时极显著高于(P0.01)对照雏鸡;Cyclin D1蛋白量显著(P0.05)或极显著(P0.01)低于对照雏鸡。结果表明,感染REV后,雏鸡免疫机能下降可能与胸腺细胞增殖能力下降、细胞周期素D1 mRNA转录及蛋白质水平的异常表达相关。     

犬Mnx1基因过表达载体的构建及其对脂肪间充质干细胞向胰岛β细胞分化的影响

本研究旨在构建犬Mnx1基因腺病毒过表达载体,并探究Mnx1基因过表达对犬脂肪间充质干细胞向胰岛β细胞方向分化的影响。本试验构建了腺病毒重组表达载体pAD-Mnx1,经293A细胞包装扩增后产生具有感染性的重组腺病毒,将其按感染复数(MOI)100感染犬ADSCs后,分别在第3、6、9、12和15天观察绿色荧光蛋白的表达情况、细胞形态变化和胰岛β细胞发育相关基因的表达情况。结果显示,ADSCs在感染后24 h出现绿色荧光,形态无显著变化;Mnx1基因表达可激发胰十二指肠同源盒1(Pdx1)基因、神经元素3(Ngn3)基因、肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(Mafa)基因、NK2同源盒2(Nkx2.2)基因、NK6同源盒1(Nkx6.1)基因、神经分化因子1(Neurod1)基因、成对合基因4(Pax4)和GATA结合蛋白4(Gata4)基因等内源性基因的表达。结果证实,腺病毒介导的过表达载体pAD-Mnx1可在犬ADSCs超表达Mnx1基因,从而诱导犬ADSCs向胰岛前体细胞分化,具有进一步诱导犬ADSCs形成胰岛β细胞的可能。     

胸腺九肽对鸡脾淋巴细胞增殖转化及IL-2基因表达与分泌的影响

采用MTT比色法、相对半定量RT-PCR法和放射免疫测定(RIA)法研究了不同浓度的胸腺九肽对离体培养的鸡脾淋巴细胞增殖转化I、L-2基因表达与分泌的影响。结果表明,用10 ng/mL和1 ng/mL胸腺九肽处理鸡脾淋巴细胞8 h后,能显著增加由ConA诱导的淋巴细胞增殖转化反应,显著提高IL-2基因的表达水平以及细胞培养上清液中的IL-2含量(P<0.05);100 ng/mL的胸腺九肽虽有增强脾淋巴细胞增殖转化反应以及提高IL-2基因表达和分泌能力的趋势,但与对照组无显著差异(P>0.05)。提示,胸腺九肽能增强鸡脾淋巴细胞的增殖转化反应,并主要在基因转录水平上促进IL-2的合成与分泌,其作用与剂量大小有关。     

牛G3BP1蛋白的原核表达及其对牛cGAS生物酶催化活性的影响

为了探究牛G3BP1(bG3BP1)对DNA识别受体cGAS生物酶催化活性的影响,本研究提取牛血液淋巴细胞中总的RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,克隆出bG3BP1基因全长;随后构建bG3BP1的原核表达载体pET-28a-SUMO-bG3BP1,将其转化至大肠杆菌中进行诱导表达,使用镍亲和层析柱对重组蛋白bG3BP1进行纯化,并切除His6-SUMO标签后再经镍柱纯化;最后将获得的bG3BP1蛋白用于牛cGAS(bcGAS)的体外酶促反应,采用ELISA方法检测酶促合成产率。结果显示,可溶性表达的bG3BP1蛋白促进了bcGAS的体外酶促反应,提高了第二信使分子2′3′-cGAMP的产率,这为2′3′-cGAMP的大规模生产及应用提供了研究思路和技术方法。