犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。     

应用反转录 - 聚合酶链技术快速检测猪瘟病毒RNA的研究

依据猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）５′端非编码区保守序列设计一对ＰＣＲ引物，建立了检测ＣＳＦＶ的反转录聚合酶链（ＲＴＰＣＲ）技术。应用该技术从猪瘟兔化弱毒感染兔的脾、淋巴结、肾与肌肉等以及石门株强毒感染猪的脾与肌肉和湖北分离毒株感染猪组织匀浆液中均特异扩增出了１条预期大小为１９４ｂｐ的片段，从实验感染兔和猪的血液中也特异扩增出了该片段，但对牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）和健康兔脾总ＲＮＡ以及健康猪的血液ＲＮＡ扩增均为阴性。采用这种方法，对实验感染兔脾总ＲＮＡ的检测灵敏度可达１０－８ｇ，表明其灵敏度足以达到临床检验的要求。     

原位PCR技术及其应用

1969年 ,Pardue等建立了核酸分子的原位杂交技术 (ISH) ,该技术能对细胞或组织内的核酸或病毒进行定位和检测 ,不仅灵敏性高而且具有准确的定位能力。但是 ,由于其只能对靶序列丰富的细胞或组织进行检测和定位 ,对低拷贝基因和单拷贝基因则无能为力 ,所以ISH的应用受到很大的限制。1985年出现的聚合酶链反应具有很高的灵敏性和特异性 ,理论上可以检测出仅有 1个病毒颗粒的细胞 ,但是该方法只能在液体状态下使用 ,需要对细胞或组织破碎以提取DNA或RNA ,也不能对细胞或组织中的病毒或基因进行定位。为了能够检测细胞或组织中的低拷贝和…     

应用PCR等核酸技术检测动物饲料中牛羊组织成分

为准确鉴别不同品种动物源性饲料,防范疯牛病及羊痒病的传播,建立了检测牛、绵羊和山羊组织种间特异的聚合酶链反应(PCR);用Mbo I、Vsp Ⅰ、Rsa Ⅰ分别对从动物饲料中检测得到的牛、绵羊和山羊组织的PCR产物进行酶切分析,酶切图谱与序列结构相符;核酸测序结果表明,3种动物组织的PCR产物序列与基因库中检索到的相应序列相吻合.用3种检测方法检测牛、绵羊和山羊组织无交叉反应,检测猪、鸡、兔和鱼等动物组织均呈阴性.PCR检测的敏感性可达0.25%(质量分数),PCR检测全过程包括样品处理,可在3 h内完成.     

应用复合PCR方法检测沙门菌的研究

参照文献报道的沙门菌Repeatse和hisJ基因片段的引物序列 ,设计并合成了 2对引物 ,对沙门菌属和非沙门菌属的标准菌株及分离菌株进行了复合PCR扩增反应。结果 ,沙门菌PCR产物均出现 199bp与 4 95bp的特异性DNA扩增条带 ,而非沙门菌均未出现扩增条带 ,证明这 2对引物具有沙门菌属特异性。将提取的沙门菌DNA做梯度稀释 ,测定该复合PCR体系的敏感度。结果表明 ,此体系可检出 10 3CFU/mL菌液提取的DNA模板。应用上述方法 ,对进境鱼粉阳性样品进行了检测 ,均出现阳性结果。本研究表明 ,复合PCR是一种特异、敏感、快速的沙门菌检测方法 ,可应用于口岸系统鱼粉、肉骨粉的日常检测。     

猫钩虫PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、敏感的检测猫钩虫的方法,根据钩虫内转录间隔区(ITS)部分序列的保守引物AF和AR,建立PCR检测方法,对反应条件进行优化,并进行特异性和敏感性试验;采用该方法对112份流浪猫粪便进行临床检测。结果显示,建立的PCR方法能特异性扩增猫钩虫相应的基因片段,其长度为404bp,与猫弓首蛔虫、犬复孔绦虫、狐毛尾线虫的虫卵的基因组DNA以及蓝氏贾第虫包囊、猫等孢球虫卵囊基因组DNA无交叉反应;最低能检测到1.07fg的钩虫基因组DNA。通过临床样品检测,该方法比碘液染色镜检的检出率提高了9%,其敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均为100%。结果表明,该PCR方法具有敏感、特异的特点,适用于钩虫的临床检测和钩虫病的分子流行病学调查。     

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16 S rDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型(1或/和2型)型特异基因序列设计了4条引物,建立了快速检测猪链球菌2型(1或/和2型)的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示,所建立的多重PCR方法特异、敏感,对组织中的猪链球菌2型(1或/和2型)的最低检出水平为30 CFU/mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测,并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证,结果显示,检出阳性符合率为100%,证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。     

内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒的研究进展

从内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒(enJSRV)与外源性绵羊肺腺瘤反转录病毒(exJSRV)基因组结构的比较、enJSRV与绵羊肺腺瘤病(OPA)的关系、enJSRV在羊体内的表达及其系统发育分析等方面综述了enJSRV的研究进展,旨在为早期诊断及预防OPA提出新方法,为揭示该病的分子发病机理及探索其基因治疗提供新思路。     

PCR检测鸭瘟病毒的研究

根据鸭瘟病毒DNA聚合酶基因序列 ,设计、合成了 1对引物 ,以 1株鸭瘟病毒疫苗株DNA为模板 ,进行PCR扩增 ,扩增出预期 5 6 3bp的目的DNA片段。将扩增出的DNA片段克隆到pMD18 T载体 ,经Amp/IPTG/X gal平板筛选 ,HindⅢ、XbaⅠ双酶切鉴定 ,获得阳性重组质粒。对重组质粒进行序列测定 ,与参考序列比较 ,二者同源性为 99.3%。小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鹅副黏病毒PCR扩增均为阴性。用此方法检测人工感染和自然感染鸭瘟的组织 (脑、肝、脾 ) ,均能检测到鸭瘟病毒DNA。PCR检测鸭瘟病毒具有高度的特异性、敏感性 ,能够用于鸭瘟急性及亚临床感染的检测与诊断     

应用PCR检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒

设计合成了 1对引物 ,建立用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒的PCR方法。结果表明 ,PCR对羊接触传染性脓疱性皮炎病毒细胞培养毒的检测与细胞培养CPE、电镜检测的结果相一致。经对扩增产物进行序列分析 ,与已报道NZ 2株的核苷酸序列同源性高达 97%。用此PCR方法扩增羊痘病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒 ,结果均为阴性。此方法用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒是可行的、特异的     

妊娠绵羊子宫内膜组织内源性反转录病毒及其受体HYAL2基因表达水平的检测

为了探究内源性反转录病毒(enJSRV)及其受体HYAL2在妊娠蒙古绵羊子宫内膜形成和发育过程中的作用,运用TaqMan实时荧光定量PCR和组织原位杂交技术对其在不同妊娠时期(30、50、70、90、110和130d)蒙古绵羊子宫内膜中的表达规律和分布定位进行了研究。实时荧光定量PCR结果显示,enJS-RV及其受体HYAL2在蒙古绵羊子宫内膜的不同妊娠时期均有表达,通过SPSS统计学软件分析可以看出,妊娠蒙古绵羊子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达于妊娠第30和50天相对较高,70～130d均低于对照组(30d),且差异都极显著,enJSRV与其受体HYAL2mRNA之间亦无线性相关性。原位杂交结果显示,enJSRV及其受体HYAL2mRNA在妊娠第30、50和130天蒙古绵羊子宫内膜的腔上皮细胞、腺上皮细胞、血管内皮细胞、间质及滋养层巨型双核细胞中均有阳性信号表达。表明enJSRV及其受体HYAL2表达于上皮细胞及上皮细胞来源的滋养层巨型双核细胞中,揭示enJSRV及其受体HYAL2在子宫形成过程中和系统防御中可能发挥重要作用。     

狂犬病病毒反向遗传学的研究进展

对狂犬病病毒反向遗传学操作系统进行了综述,论述了狂犬病病毒反向遗传操作技术的发展状况,并对反向遗传学操作技术在狂犬病病毒致病机理、狂犬病疫苗以及病毒载体研究中的应用进行了综述,对各种病毒拯救方法进行了比较,并对狂犬病病毒反向遗传学操作技术的应用进行了初步探讨。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白基因序列,设计合成了1对特异性引物,以CDV疫苗株ONP为模板,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测CDV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RT-PCR扩增,能得到与理论设计值大小一致的242bp的特异性条带;该方法最低可以检测出约20pg含量的CDV;对已知CDV阳性和阴性病料进行重复性和稳定性试验,结果均一致;用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)和同为副黏病毒科的新城疫病毒(NDV),均无交叉反应;对32份临床病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测试纸检测结果进行比较,符合率为93.75%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,重复性和稳定性均好,可用于犬瘟热病毒的临床诊断和试验研究。     

PCR技术在鸟类性别鉴定上的应用

根据鸟类性染色体连锁基因EE0．6在Z、W染色体上长度的不同,通过选择6对不同的引物,同时设置4种不同的反应条件,分别采用PCR技术对丹顶鹤、黑鹳、琉璃金刚鹦鹉、绯红金刚鹦鹉、鞭苔(?)鵼、戴冕鹤、火烈鸟的Z、W染色体上的EE0．6基因进行了特异性扩增。结果显示,某些引物组合能从雄鸟样品中扩增出1条片段(EE0．6Z,190 bp),而雌性鸟样品则能扩增出2务片段(EE0．6W和EE0．6Z,分别为250 bp和190 bp),但4组引物对6种鸟类EE0．6基N的扩增效果不同。证实,利用PCR技术能对鸟类进行性别鉴定。     

印第安纳型水疱性口炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

根据印第安纳型水疱性口炎病毒(VSV)L蛋白的序列,设计了一套特异性引物,建立了检测VSV核酸的一步法RT-PCR方法,并用该法检测了不同的组织样品。结果显示,人工感染VSV小鼠组织检测为阳性,而口蹄疫、猪水疱病、猪瘟、猪生殖与呼吸综合征等病料检测均为阴性,表明该方法具有较好的特异性。     

鹅细小病毒强毒PCR检测方法的建立

参照GenBank中登录的鹅细小病毒 (GPV)B株的全基因序列 ,针对GPV的VP3保守基因设计了 1对引物 ,建立了GPV的PCR检测方法。采用该方法检测GPV能够扩增出预期大小约 4 41bp的特异性片段 ,而对鸭瘟病毒 (DPV)、鹅源致病性大肠埃希氏菌 (E .coli)O8和O1、雏鹅新型病毒性肠炎病毒 (NGVEV)呈阴性反应。该法检测GPV核酸的灵敏度可达 0 .4 7pg ;对GPV强毒皮下注射感染雏鹅各器官的检测结果表明 ,感染后 8h即可从心、肝病料中检出病毒DNA ,感染后 2 4h可从延髓、胸腺、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠、腔上囊、心、肝、脾、肺、肾、血液、小脑、直肠、肌肉、粪便中检出GPVDNA ,感染 4 8h后可从骨髓中检出病毒DNA ,感染 312h后仍能从十二指肠、空肠、盲肠、心、肝、肾、粪便中检出病毒DNA。病毒分离阳性的可疑病料PCR检测为阳性 ,对临床送检病料的检测结果表明 ,PCR的敏感性显著高于病毒分离。     

大熊猫轮状病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的大熊猫轮状病毒(RV)VP7基因序列,设计了1对特异性引物,建立了快速检测大熊猫RV的RT-PCR方法.用该方法对MA-104细胞增殖的大熊猫RV进行RT-PCR扩增,结果得到与试验设计相符的342 bp的特异性扩增条带,而对传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增结果为阴性.测序比对结果证实该体系检测结果准确;该方法最低可检测出约1 pg的病毒核酸;重复性试验结果显示,其检测重复性好,提示该RT-PCR方法可用于大熊猫RV的临床快速检测.