28株禽源多杀性巴氏杆菌热浸抗原的分型研究

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)是禽出血性败血症(即禽霍乱)的病原体,其抗原结构甚为复杂。中国兽药监察所以及河北、四川、吉林、广东等地对我国禽源多杀性巴氏杆菌的K、O抗原进行了大量的分析研究,确认我国各地绝大多数的禽源多杀性巴氏杆菌的O抗原为5,K抗原为A,( 5:A),但利用琼脂扩散法(Agar diffusion method)鉴定禽源多杀性巴氏杆菌的热浸抗原的分析研究,报道较少。我们参考Heddleston的研究方法,对28株禽源多杀性巴氏杆菌进行了琼扩分型鉴定,以了解我国禽源多杀性巴氏杆菌的血清型,为进一步研究各种分型方法的关系以及为研制理想的禽霍乱菌苗提供理论根据。     

禽多杀性巴氏杆菌荚膜多糖—蛋白复合物对鸭的安全性和免疫原性试验

禽霍乱又称禽出败,是由多杀性巴氏杆菌引起的禽类的一种急性败血性传染病。对养禽业危害较大。我国迄今虽研制出多种禽霍乱灭活苗和弱毒苗,对控制本病流行起到了一定的作用,但安全性、稳定性及免疫期仍不够理想。多年来国外对禽巴氏杆菌荚膜抗原     

鸡IL-18对禽多杀性巴氏杆菌DNA疫苗的免疫佐剂作用

为了探索鸡IL-18在禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗中的免疫佐剂作用,分别用共表达鸡IL-18基因和禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗、鸡IL-18真核表达质粒pcDNA3/cIL-18与禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗混合物、禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗肌肉注射5周龄鸡,首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击。结果鸡IL-18能够明显增强禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗的免疫原性,显著提高免疫鸡的体液免疫和细胞免疫水平,并且鸡IL-18与禽多杀性巴氏杆菌H基因共表达时的免疫佐剂作用最强,能强有力地抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击。结果表明,鸡IL-18可作为DNA疫苗的一种理想的免疫佐剂。     

禽多杀性巴氏杆菌不同抗原成分致敏绵羊红细胞的试验

禽多杀性巴氏杆菌不同抗原成分致敏绵羊红细胞的试验韩雪清，梁惠珍，刘湘涛，李彦敏，朱有福（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）刘湘涛等对禽多杀性巴氏杆菌（ＰＭ）不同抗原成分的分析，认为ＰＭ的优势抗原富集于荚膜和胞质离心１１００００ｇ上清中。本试验...     

多重PCR在多杀性巴氏杆菌荚膜定群中的应用

为了修订行业标准《猪巴氏杆菌病诊断技术》(NY/T 564-2002),改进多杀性巴氏杆菌荚膜定群方法,制备了多杀性巴氏杆菌分群抗血清,并建立了多重PCR,对53株菌同时用血凝方法及多重PCR进行定群。经正向间接血凝试验测定,制备的各型血清仅与对应型抗原发生凝集反应,表明血清具有较高的特异性,可作为多杀性巴氏杆菌的荚膜定群抗血清。53株多杀性巴氏杆菌均扩增出了相应的预期片段,PCR结果与Carter氏间接血细胞凝集试验结果相一致。结果表明,可将多重PCR增添至行业标准中,用其代替原有血清学方法进行多杀性巴氏杆菌荚膜定群。     

禽多杀性巴氏杆菌亚单位成分的免疫原性研究

禽多杀性巴氏杆菌是禽霍乱的病原,该病对养禽业危害较大,目前尚无理想的免疫制剂。学者们在筛选弱毒苗和研制灭能苗的同时,在研制禽多杀性巴氏杆菌亚单位苗方面作了一些尝试,为禽霍乱的免疫研究开辟了一条新路。本文就其亚单位成分的免疫原性、诱导产生保护作用及血清学反应等加以阐述。     

禽多杀性巴氏杆菌交叉保护因子的研究

禽多杀性巴氏杆菌交叉保护因子存在活鸡体培养物中。本文用鸡 活体培养禽多杀性巴氏杆菌C_(48-1)强毒株(血清1型),在菌血症时采血经 差速离心收获细菌,制成的死菌苗对异型菌株C_(44-42)(血清3型)和P_(1059) (血清3型)攻毒产生交叉保护作用。而41℃肉汤培养的C_(48-1)菌株则不具有这种交叉保护作用。 活体培养的细菌经冻融、溶菌酶、透明质酸酶、DN_(ase)、EDTA、Triton X-100等处理溶解后,细菌溶解物对异型菌株保护率达100％,而其溶解物的上清和沉淀时异型菌株保护率也达66.7％及80％。而溶解物沉淀经蛋白酶处理后,则失去了交叉保护能力,说明产生交叉保护作用的交叉保护因子(CPF)可能是蛋白质。 生化分析表明,活体培养的禽多杀性巴氏杆菌和肉汤培养的禽多杀性巴氏杆菌其物质含量是不同的。活体培养的细菌溶解物含CPF,其蛋白与糖含量比(P/C)为3.97:1,而肉汤培养的细菌P/C为1.01:1。SDS-PAGE分析表明,有一分子量在17200～30000之间的蛋白成分仅存在于活体培养的细菌中,经测算其分子量大约为19320。这些研究表明,分子量为19320的蛋白质可能就是存在于活体培养物中的交叉保护因子。     

猪源荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为确定导致猪细菌性感染死亡的病原,从送检病死猪肺中分离纯化出1株细菌,通过对该菌株进行培养特性观察、生化反应、药敏试验、动物致病性试验,并采用PCR对该分离菌株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰染色为阴性。生化试验及PCR鉴定结果显示,该分离菌株为荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌,其对小鼠有强致病性。此次分离的这株多杀性巴氏杆菌形态结构和生化特性比较典型,毒力较强,且为较少见的荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌。这一结果为进一步研究多杀性巴氏杆菌的致病机理奠定了基础。     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对云南某鸡场发生鸡急性死亡的疑似禽霍乱病例进行病原确诊,无菌采集送检死鸡肝脏组织进行细菌分离培养、生化鉴定、细菌16S rRNA基因分析及荚膜分型鉴定,对分离菌株进行耐药性、致病性分析。结果,该分离菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌;药敏试验表明,分离菌对头孢氨苄、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林等8种药物敏感,对大观霉素、复方新诺明等6种药物中度敏感,对卡那霉素、链霉素、四环素等12种药物耐药;耐药基因检测显示,该分离株仅含有磺胺类sul2基因和四环素类tetB基因;动物试验表明,接种500 CFU的45日龄鸡在接种后7 d内全部死亡,接种12.5 CFU的小鼠在接种后48 h内全部死亡,死亡小鼠病理组织切片显示各器官均有不同程度的病变。上述结果表明,该分离株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌强毒株,是该鸡场发生疫情的病原。本研究结果为我国鸡源多杀性巴氏杆菌的遗传特性研究提供了基础资料。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1成熟外膜蛋白H重组亚单位设苗免疫效果的研究

将融合表达禽多杀性巴氏杆菌成熟外膜蛋白H(OmpmH)的重组菌pGEX-ompmH/BL21大量培养,在最佳诱导条件下诱导表达,表达产物经蛋白酶剪切及亲和层析纯化,得到OmpmH基因的原核表达产物,将其与弗氏完全佐剂混合制成油乳剂亚单位疫苗,用该疫苗肌肉注射接种5周龄鸡,首免后每周采血检测抗体,二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击.结果显示,OmpmH具有良好的免疫原性,能诱导鸡体产生特异性抗体,可抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击,免疫效果优于禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗.     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对云南某鸡场发生鸡急性死亡的疑似禽霍乱病例进行病原确诊。无菌采集送检死鸡肝脏组织进行细菌分离培养、生化鉴定、细菌16S rRNA基因分析及荚膜分型鉴定，对分离菌株进行耐药性、致病性分析。结果，该分离菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌；药敏试验表明，分离菌对头孢氨苄、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林等8种药物敏感，对大观霉素、复方新诺明等6种药物中度敏感，对卡那霉素、链霉素、四环素等12种药物耐药；耐药基因检测显示，该分离株仅含有磺胺类sul2基因和四环素类tetB基因；动物试验表明，接种500 CFU的45日龄鸡在接种后7 d内全部死亡，接种12.5 CFU的小鼠在接种后48 h内全部死亡，死亡小鼠病理组织切片显示各器官均有不同程度的病变。上述结果表明，该分离株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌强毒株，是该鸡场发生疫情的病原。本研究结果为我国鸡源多杀性巴氏杆菌的遗传特性研究提供了基础资料。     

禽多杀性巴氏杆菌C_(48—1)染色体基因文库的构建

本文以Cosmid作载体,用细胞株SMRIO制备包装细胞,运用体外重组和体外包装技术,构建了禽多杀性巴氏杆菌C_(48-1)染色体基因文库。每微克染色体DNA可获得1000～2000个转导子。为进一步研究禽多杀性巴氏杆菌的基因特性和筛选某些基因或者克隆与表达抗原有关的基因打下了基础。     

猪多杀性巴氏杆菌PlpP基因的原核表达及其免疫保护性的研究

为研究猪多杀性巴氏杆菌PlpP基因的免疫保护性,根据GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌全基因组中的PlpP基因序列,对目的基因进行PCR扩增,并将PCR片段克隆至载体pET-28a(+)中,再将重组表达质粒pETPlpP转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。序列分析表明,得到了1条大小为945bp的基因片段,与预期大小相符。SDS-PAGE检测结果证实,该基因可以在BL21(DE3)中表达,表达产物为分子质量约45ku的融合蛋白。将纯化的重组蛋白pETPlpP制备成亚单位疫苗,并经皮下途径免疫小鼠,二免后第2周均以5LD50的A、B和D这3种荚膜抗原血清型的多杀性巴氏杆菌分别对小鼠进行攻毒,结果显示,A、B和D这3种血清型的保护率分别是16.67%、33.33%和66.67%。上述结果说明PlpP蛋白具有一定的免疫保护性。     

禽霍乱菌苗研究概况

禽霍乱的记述最早见于1782年法国的Chabert所作的报道,其后Mailet(1836)对该病进行了研究,并首先采用禽霍乱(FowI Cholera)这一名称,Rivolta(1877)以及Peroncia和Semmer(1878)通过显微镜在鸡血中发现了两极着色的小杆菌,从而确定了该病的病原。最早用禽巴氏杆菌研制成菌苗的首推Pasteur(1881),在人工培养基上静置培养数月的方法致弱禽巴氏杆菌,获得了两种毒力不同的弱毒苗,用此培养物接种鸡获得了一定的免疫力,但在实际使用中效果不稳定,未能推广。以后,各国兽医科学工作者对该病的菌苗研制、免疫机制的探讨上做了大量工作,有关报道文献众多,自从Pasteur首创弱毒菌苗至今     

禽多杀性巴氏杆菌C_(48-1)成熟外膜蛋白H重组亚单位疫苗免疫效果的研究

将融合表达禽多杀性巴氏杆菌成熟外膜蛋白H(OmpmH)的重组菌pGEX-ompmH／ BL21大量培养,在最佳诱导条件下诱导表达,表达产物经蛋白酶剪切及亲和层析纯化,得到Ompm H基因的原核表达产物,将其与弗氏完全佐剂混合制成油乳剂亚单位疫苗,用该疫苗肌肉注射接种5周龄鸡,首免后每周采血检测抗体,二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1 进行攻击。结果显示,OmpmH具有良好的免疫原性,能诱导鸡体产生特异性抗体,可抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击,免疫效果优于禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为确定黑龙江省2个规模化奶牛场犊牛急性呼吸道感染的病因,笔者进行了病原的分离纯化,细菌16S rDNA基因和多杀性巴氏杆菌特异性基因OmpH鉴定、生化试验、药敏试验、半数致死量试验、荚膜血清型分型及22种毒力因子的检测,以确定主要病原的种类、型别及生物学特性。结果表明,从死亡牛肺和患病牛鼻拭子分离的2株病原菌均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,分别被命名为WC16551和LY01,序列分析结果表明,其与牛源多杀性巴氏杆菌同源性达到99%以上。药敏试验显示2株菌均对恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。半数致死量结果表明,LY01菌株的毒力明显强于WC16551菌株,2株分离菌均携带19种毒力因子,未检出hgbB、toxA和nanB三种基因。上述研究结果表明,导致2个牛场发病的主要病原菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌。     

趋化因子配体5及趋化因子受体5在人工感染多杀性巴氏杆菌的鸡脾内的动态表达

给20日龄伊莎褐蛋鸡皮下注射多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)建立了禽霍乱动物模型,以感染后第4、12、24、48、120小时为时间点采样,运用病理学技术和免疫组织化学方法,研究被感染鸡的肝、脾病理学变化及脾内趋化因子配体(CCL5)及趋化因子受体5(CCR5)的动态表达。结果显示,雏鸡感染多杀性巴氏杆菌后发现明显局灶性肝坏死和脾内淋巴细胞减少,脾内CCL5和CCR5的表达量在感染后第48小时明显上升,尤其是感染后第24小时表达量最高,均明显高于对照组(P0.05),且与病变严重程度呈正相关。感染后第120小时趋于正常。结果表明,多杀性巴氏杆菌可以刺激蛋鸡脾内CCL5和CCR5表达的一过性上调,这种反应在禽霍乱鸡的肝、脾损伤过程中可能发挥重要的生物学作用。     

四川省畜禽多杀性巴氏杆菌菌体抗原的血清学鉴定

1955～1961年,Carter氏用间接血球凝集法,根据菌株的不同荚膜物质,将多杀性巴氏杆菌分为A、B、D、E四型。1961年,Namioka和Murata氏以1N盐酸处理细菌,制成菌体抗原,用试管凝集法,将菌体抗原分为不同的1、2、3……12种变异群,并与Carte氏的荚膜群相结合,形成15个血清型。为了查明我省畜禽多杀性巴氏杆菌的血清学型别,我们在荚膜抗原分群的基础上,对从416株中选出的有代表性的171株菌,采用Namioka和Murata氏叙述过的分型法,进行了菌体抗原的血清学鉴定。     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2014年3月至2015年2月从来源于全国15个省份的180份临床猪肺组织样品中共分离到71株多杀性巴氏杆菌,分离率为39.4%。利用PCR技术对所分离的多杀性巴氏杆菌进行荚膜血清型鉴定,其中A型菌株41株(占57.8%),D型菌株27株(占38.0%),F型菌株3株(占4.2%),71株多杀性巴氏杆菌中包括1株D型产毒素多杀性巴氏杆菌(占1.4%),说明当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A型和D型菌株。应用PCR检测多杀性巴氏杆菌23种毒力基因,结果显示:多杀性巴氏杆菌毒力基因的数量大多分布在15~19之间,平均携带个数为17.5个;23种毒力基因中,ptfA,fimA,hsf-2,sodA,sodC,ompA,ompH,oma87,plpB,exbB,tonB,Fur,hgbB的检出率在90%以上,而toxA基因的检出率极低(1.4%),并且在猪源多杀性巴氏杆菌中未检测到t bpA的存在;分析毒力基因在不同血清型菌株中的携带及分布情况发现,A型的平均毒力基因携带数为18.2个,D型为16.4个;不同毒力基因在不同血清型的多杀性巴氏杆菌中的分布也存在一定的差异,其中唾液酸代谢酶基因nanB、透明质酸酶基因pmHAS及黏附基因tadD和pfhA在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率高于其在D型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01);而黏附基因hsf-1在D型多杀性巴氏杆菌的检出率显著高于其在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01)。对所分离菌株的16SrRNA基因进行测序,并与NCBI上公布的10株多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因进行进化树分析,结果显示:71株多杀性巴氏杆菌主要分为2个亚群,亚群Ⅰ和HB03及3480的亲缘关系较近,而亚群Ⅱ则与HN06、Pm70、36950等菌株的亲缘关系较近;遗传进化的结果说明,多杀性巴氏杆菌的亲缘关系与其来源、血清型及其导致的疾病种类并没有表现出特定的亲缘关系。     

间接血凝试验检测鸡血清中多杀性巴氏杆菌抗体

近几年来,国内外对禽多杀性巴氏杆菌(Pas-teurella multocida)的免疫应答研究表明,体液免疫和细胞免疫在抵抗巴氏杆菌的再感染均有重要的作用。并应用试管凝集反应、间接血凝(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等检测多杀性巴氏杆菌免疫后鸡和火鸡的血清抗体,并认为此3种方法所检出的抗体滴度与对抗强毒的保护作用一致。本研究优化了检测鸡血清抗体的IHA试验及抗原制备的条件,并比较了IHA滴度与攻毒保护的关系。(一)材料和方法1.菌种:中国兽医药品监察所保藏的C_(48)-1强毒菌株,用前通过小白鼠3代,鸡1代复壮,然后接种于血液马丁肉汤或血液马丁琼脂培养,培养移植不超过3次,菌液10~(-8)稀释0.1ml(含2～