A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒的构建及其免疫效力的研究

为构建A型塞内卡病毒(SVA)P12A-3C基因的真核表达质粒,提取SVACH-FJ-2017株的RNA,经RT-PCR方法扩增得到衣壳前体蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因,利用融合PCR方法获得P12A-3C基因并将其构建到真核表达质粒pc DNA~(TM)3.1/myc-His(-)上,获得表达质粒pCD-P12A-3C,用脂质体Lipofectamine~(TM)2000将该质粒转染293T细胞后,进行间接免疫荧光(IFA)检测;且用Myc单抗和SVA VP1单抗进行Western-blot分析;大量提取并纯化表达质粒,免疫小鼠后用间接ELISA法检测抗体水平变化情况。结果,SVA真核表达质粒pCD-P12A-3C经酶切及测序鉴定证明构建正确,转染293T细胞后IFA可见明显的绿色荧光,表明P12A-3C基因可在细胞内表达;将转染细胞裂解后进行Western-blot分析,结果显示该质粒可表达3C蛋白,且表达产物可与SVA VP1单抗发生特异性反应;免疫小鼠后抗体检测结果表明,二免后第14天,免疫小鼠抗体水平比对照组明显增高;该结果表明本研究构建的真核表达质粒pCD-P12A-3C可正确表达相应蛋白,且所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。结论:本研究成功构建了A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒并进行了免疫效力初步验证,为A型塞内卡核酸疫苗的研制奠定了基础。     

新城疫病毒ClassⅠ强毒株L基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法从新城疫病毒(NDV)ClassⅠ强毒株9a5b中扩增出了L基因C末端的基因片段,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,测序验证后转化入表达宿主菌BL21进行IPTG诱导表达,表达的蛋白接种8周龄BALB/c小鼠,制备L蛋白的单克隆抗体,用间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western-bolt方法共同检测所获得的抗体。结果显示,重组菌可表达出分子质量约为39ku的重组融合蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。多种方法筛选显示成功制备了4株单克隆抗体。免疫特异性鉴定结果表明,在所获得的单抗中,4株单抗均具有ELISA和IFA效价,且4株单抗与ClassⅠ毒株的反应均强于与ClassⅡ毒株的反应。     

牛分枝杆菌PtpA基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为深入研究牛分枝杆菌PtpA基因在细胞免疫过程中所发挥的具体调控作用,本研究以牛分枝杆菌基因组为模板扩增得到PtpA基因,通过分子克隆的方法构建完成PtpA基因原核表达载体,并将表达载体质粒转入感受态细菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,在约35 ku处可见特异性蛋白条带。以抗组氨酸标签(HIS)单抗为一抗,对表达产物进行Western-blot检测,结果显示,表达产物可与抗HIS标签单克隆抗体发生特异性结合,证明该蛋白为所需的PtpA蛋白。通过免疫新西兰大白兔获得抗PtpA血清,所得血清用间接ELISA方法测得的血清抗体效价超过1∶1 000 000,具有较好的灵敏性。采用制备的PtpA多克隆抗体检测表达纯化的PtpA融合蛋白及真核表达的PtpA蛋白,结果可在约35 ku和约20 ku处产生特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。本研究为后续PtpA基因调控细胞免疫的具体机制的研究奠定了基础。     

猪乳转铁蛋白N端活性区的表达和多克隆抗体的制备

在采用亲和层析技术筛选猪嗜血霉形体表面黏附蛋白MSG1相关受体的过程中,发现猪乳转铁蛋白(LTF)可能是MSG1蛋白的潜在受体。为了对其受体功能进行确认,对截短的猪乳转铁蛋白进行了原核表达和多克隆抗体的制备。首先,以人工合成的猪乳转铁蛋白全基因为模板,通过PCR扩增猪乳转铁蛋白基因N端762个碱基后连接入pET-32a(+)载体中。其次,将重组质粒导入大肠杆菌BL-21感受态细胞中用IPTG进行蛋白诱导表达,对表达的重组蛋白用His单抗进行特异性鉴定,并对鉴定后的蛋白应用包涵体洗液进行纯化。最后,以纯化的蛋白通过背部多点皮内注射免疫小鼠和家兔制备多克隆抗体。结果,重组蛋白的分子质量在44ku左右,能够与His单抗发生特异性反应。Western-blot反应证明,制备的鼠和家兔多克隆抗体具有高度的特异性。猪乳转铁蛋白鼠和家兔多抗的制备为猪乳转铁蛋白受体功能的确认和激光共聚焦对其定位提供了技术储备。     

ClassⅠ新城疫病毒强毒株主要结构蛋白特异性抗体的研制

以新城疫病毒(NDV)ClassⅠ强毒分离株9a5b尿囊液、原核表达的NP、P、M、HN、F五种蛋白为免疫原,接种6周龄BALB/c小鼠制备抗体,用血凝抑制试验(HI)、间接免疫荧光试验(IFA)、细胞中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western-blot方法共同检测所获得的各类抗体。结果显示,成功制备获得了NDV各结构蛋白多抗及12株NDV特异性单抗。免疫特性鉴定结果表明,在获得的12株单抗中,3H7和3H9株单抗为抗ClassⅠHN特异性单抗,仅具有IFA和HI效价,而2A8株单抗却无HI效价;其他单抗均与ClassⅡ毒株存在交叉反应。     

肠炎沙门菌效应蛋白AvrA的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)avr A基因功能及其在感染过程中的表达分布情况,本研究通过PCR技术克隆获得了avr A基因,并构建了肠炎沙门菌Avr A原核表达载体p Cold-avr A,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;表达蛋白经纯化后免疫小鼠获得Avr A多克隆抗体,通过Western-blot检测了抗体特异性。结果显示,成功构建了表达载体p Cold-avr A,并获得了纯化的Avr A蛋白,成功制备了小鼠抗Avr A蛋白的多克隆抗体,可用于检测细菌Avr A蛋白的表达。本研究成功获得纯化的Avr A蛋白及其多克隆抗体,为进一步探讨Avr A在肠炎沙门菌感染过程中所发挥功能奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

将合成的非洲猪瘟病毒K205R基因序列插入p ET-28a(+)表达载体,经IPTG诱导表达p ET-28aK205R重组蛋白。用制备的重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用化学融合方法融合、筛选,获得了6A4、7F5和7G3三株抗K205R蛋白的杂交瘤细胞株。经鉴定,这3株单克隆抗体(单抗)的亚类均为Ig G1型;单抗的腹水效价分别为1∶51 200、1∶409 600和1∶102 400。将这3株杂交瘤细胞连续培养20代,在第20代仍有很高的分泌抗体的能力,表明其稳定性较好。Western-blot检测结果表明,这3株单抗与K205R重组蛋白有良好的反应性和特异性。上述结果表明,本研究制备的这3株杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗体,分泌的抗体特异性高,为非洲猪瘟诊断技术的研究奠定了基础。     

牛结节性皮肤病病毒ORF006蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF006蛋白的生物学功能,制备了ORF006基因的多克隆抗体,用PCR技术获得LSDV ORF006的基因片段克隆至pET-28a原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,LSDV ORF006基因全长约696 bp;pET-28a-ORF006重组质粒在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约28.0 ku目的蛋白;ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶102 400;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别ORF006蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别LSDV感染MDBK细胞表达的ORF006蛋白。本研究为进一步探究LSDV ORF006蛋白生物学功能奠定了基础。     

噬菌体抗体库技术及其研究进展

随着分子生物学和细胞生物学技术的发展 ,抗体的研究已进入基因工程抗体时代。 2 0世纪 90年代初 ,抗体库技术特别是噬菌体抗体库技术的问世 ,成为抗体技术的重大突破 ,标志着利用噬菌体表面展示技术制备人源化、多功能化、高亲和力特异性抗体成为可能。噬菌体抗体库技术是用PCR扩增出抗体的全套可变区基因 ,将抗体分子DNA片段如Fab或单链抗体ScFv与噬菌体外壳蛋白基因PⅢ或PVⅢ连接 ,使融合蛋白表达于噬菌体颗粒的表面 ,就形成了噬菌体抗体库 ,经过“吸附、洗脱、扩增”过程富集筛选特异性抗体 ,这一技术将抗体基因型与表型联系在一起…     

猪囊尾蚴凋亡蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达

为了探究凋亡蛋白酶抑制剂基因在猪囊尾蚴生活过程中的作用,利用RT-PCR技术克隆了猪囊尾蚴凋亡蛋白酶抑制剂基因,并将其克隆至原核表达载体p ET-30a中,转化大肠杆菌BL21(D E3),经IPTG诱导后,用SDS-PAGE进行初步分析,在53 ku处出现明显的蛋白条带,与预期结果一致。W estern-blot结果表明,重组融合蛋白能够与抗H is特异性抗体发生反应。凋亡蛋白酶抑制剂基因的成功表达为后续对其功能进行研究奠定了基础。     

俄语“人体成语”的认知语义分析——以带глаз,нос的成语为例

“人体成语”是指含有表示人体各部位名称及关于人的知、情、意、行等语素的成语。俄语成语中与人体有关的成语所占比例较高，其中使用频率较高的是带глаз,нос的成语。从认知角度对俄语“人体成语”的构成成素进行分析，区分人体成语的概念意义和范畴意义，用隐喻模式和换喻模式对“人体成语”进行认知语义分析很有必要。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

俄罗斯科学院东方学研究所

俄罗斯科学院东方学研究所是俄罗斯最大的东方学研究机构。东方学研究所及其下属的圣彼得堡分所,是俄罗斯研究中国问题时间最长的机构之一。研究所机构设置齐全,既是科学研究机构,也是博物馆和图书馆,在国际学术界占有重要地位。历史渊源东方学所至今已有180年历史。1818年,东方学所的前身——俄罗斯皇家科学院亚洲博物馆在圣彼得堡成立。首任馆长为克里斯汀·弗伦院士。成立之初,亚洲博物馆主要收藏各种来自东方的文物和文献,当时博物馆最重要的藏品是彼得大帝的遗书。到19世纪初,俄罗斯探险家在中亚和中国西北地区掠夺的大量珍贵文献和文…     

"中国学派"国际关系理论的本体论认知

"'中国学派'国际关系理论框架到底是什么"已成为学界关注的一个重要问题.本文立足中国哲学的文化根基,同时尊重马克思主义的思想传统,将两者融合成新的本体论认识,以"陆王"心学的认识论作为过渡进一步论述儒家思想在国际关系方面的方法论原则,提出"中国学派"国际关系理论的基本认知,尝试在哲学意义上回答"‘中国学派'国际关系理论框架到底是什么"这一问题.     

对苏获波兰战俘问题的系统考察

本文依据档案资料,对苏获波兰战俘问题的各个环节进行了较为系统的考察,一方面比较清楚地交代了苏联对波兰战俘采取的一系列政策措施,如部分遣返、分类关押、劳动使用、思想教育、侦探肃反和秘密处决等,另一方面也比较清楚地交代了被关押战俘的生活状况、思想情绪、人数变化和不幸遭遇以及所有波兰战俘的流向和归宿.对于"卡廷惨案"被公布于世后苏联围绕该案所作的各种自欺欺人的文章,本文也进行了较为详细的披露和叙述.     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

印度软件企业国际化的效应分析

印度软件企业国际化对经济社会既有正面效应,又有负面效应。对宏观经济的积极影响主要是促进了印度经济的增长,对微观经济的正面效应主要表现在培育壮大了本土软件企业和企业家队伍。对经济社会的负面效应主要表现在:过分依赖出口导致机会成本增大,阻碍了技术对国内市场的溢出效应;产业空间集聚导致区域经济发展失衡;贫富差距拉大导致社会矛盾激化等。     

海豹静脉给药位置及操作的探讨

海豹皮下脂肪很厚,给药途径大多采用投喂和肌肉注射方式,对病海豹通过静脉给药在国内尚未见报道。1997年笔者对2例病海豹在后肢掌部进行了静脉给药,效果满意。1　操作方法1.1　保定　对先后患病的2只海豹装入比海豹个体稍大、用铁条做的笼内,用木板、木棍等分别以海豹不同部位插进使其不能调头和退出,然后将海豹后肢的笼门适当抽开,让海豹双后肢置于笼外。1.2　静脉位置　选取后肢掌部外侧的皮下静脉。1.3　给药方法　找出静脉血管并使其显露,用4号针头静脉穿刺,待有血液回流输液管后,即可静脉推注给药。2　结果第1例病海豹经诊断为肺炎和出…