SMART:自主研发的混合STR图谱分析系统

目的混合STR图谱的分析是法医遗传学领域的一个难题。目前国内大多数法医DNA实验室依靠人工方法分析混合STR图谱,费时费力,且拆分效果也多有主观性,难以满足日益增长的混合STR图谱分析的需求。本文介绍一套自主研发的混合STR图谱分析系统——SMART(STR Mixture Analysis and Resolution Tools),其能够实现对混合STR图谱的自动化分析,包括拆分混合STR图谱和计算似然比。方法SMART使用的STR峰高的概率模型,考虑了影子峰、降解、基因座特异性扩增效率、峰高变异、插入峰、峰丢失等因素。模型通过比较各个基因型集合拟合当前混合STR图谱的似然值大小来推断最有可能的基因型集合,采用了马尔可夫链蒙特卡洛(MCMC)算法进行求解。结果SMART可应用于不同试剂盒和遗传分析仪产生的数据。经使用ABI-3500XL遗传分析仪和Global Filer试剂盒测试,SMART能够实现对2~5人的混合STR图谱的分析,输出包括混合比例、混合图谱质量、各个贡献者单人的STR基因分型、似然比等多项结果。结论SMART作为一款自主研发的混合STR图谱分析系统,其基本涵盖了国外同类分析系统所具有的功能,技术性能指标达到国际先进水平,能够满足一线法医工作者对于混合STR图谱分析的多样化需求,提高混合STR图谱结果的利用率。     

两种混合STR分型分析软件的比较与应用

随着DNA技术的发展和应用拓广,案件现场生物检材及其提取检验愈受重视、愈显重要性,近年来混合检材的DNA有效检出比例越来越高,混合STR分型的拆分与合理解释也益发成为DNA鉴定技术领域的研究热点与难点。本文主要针对当下国际主流的两款混合分型分析软件——STRmix和云算GPM进行比较研究,就两者的基本信息、理论、分析过程作比较,并结合实战应用和典型案例综合分析两者的异同,希冀为法医DNA工作者提供选用参考和使用依据,也希望能够推动国内混合STR分型分析的发展及与国际交流互鉴。     

运用二代测序技术拆分混合STR分型

目的探讨二代测序技术在混合STR分型拆分中的应用。方法对一例强制猥亵妇女案中受害人颈部的拭子和血样作DNA提取,以Precision ID GlobalFiler^TM NGS STR Panel v2试剂盒制备文库,经Ion S5测序仪测序,运用Torrent_Suite_v5.2.1软件进行数据分析后,将检测基因座的序列多态STR分型与长度多态STR分型进行比较。结果在D8S1179、D21S11、D2S441、D2S1338、D10S1248五个基因座发现存在序列特异的等位基因亚型,利用这些亚型对混合STR分型进行了成功拆分。结论二代测序技术提供的等位基因序列信息可对混合STR分型的拆分起到帮助作用。     

随机模拟法进行混合样本拆分分析

目的以随机模拟法对大量混合样本拆分进行统计分析。方法在Identifiler、PP18D、AGCU EX20、PP21、AGCU EX20&AGCU 21+1等5个系统中,使用自主研发软件模拟100万组混合样本,每组逐个拆分,统计平均拆分基因座数(L)和平均拆分组合数(Π)。结果 Identifiler、PP18D、AGCU EX20、PP21、AGCU EX20&AGCU 21+1系统的L分别为4.8、5.8、6.7、7.0、11.1;Π分别为3.71×104、1.06×105、3.34×105、6.40×105、2.48×1012。结论本文结果对于混合样本拆分具有一定的指导意义。     

混合样本中不同比例STR检出率的比较

在实际案件检验中,常遇到2个个体的混合样本只检出单一STR分型的情况,如果只单纯地通过图谱认为是单一来源,就有可能偏离案件的实际情况,丢失重要的DNA信息.很多情况下,是由于次要贡献者比例太低引起主要贡献者优势扩增而导致的假单一STR情况.     

混合样本拆分查询犯罪嫌疑人的应用研究

目的对一起杀人案中的混合样本进行拆分，期望获得嫌疑人的单-分型，以便于DNA数据库检索查询。方法采用专家人工拆分和图挖掘拆分对混合样本进行拆分，结果入“DNA快速协查比对平台”检索。结果2种方法先后比中数据库中同一前科人员。结论对2人份混合样本进行拆分，在DNA数据库中直接查找犯罪嫌疑人，是一种新的办案思路。     

9个miniSTR基因座在烧骨中的检测与分型

目的对300℃焚烧后成人股骨样本进行9个miniSTR（D20S1082、D6S474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3S4529、D2S441、Amelogenin）基因座的检测与分型。方法样本为8根经300℃焚烧后的成人股骨,用改良酚-氯仿法提取烧骨DNA,在Mastercylcerpro梯度PCR仪上对9个miniSTR基因座分别进行扩增,3130基因分型仪检测并收集电泳结果,GeneMarkerV2.2.0软件计算扩增产物片段相对大小以及进行样本基因型分型。结果8根烧骨样本均能够提取到DNA,浓度平均值为25ng/μL,D260/D280值在1.7~1.9之间。9个miniSTR基因座在样本中的检出率在78%~100%之间,分型图谱较清晰,个别样本出现额外带。结论本文9个miniSTR基因座分型检测的方法,可用于对烧骨捡材的DNA分型检验。     

无比对样本的STR混合分型分析策略

目的充分利用数据库的比对功能,指导无比对样本混合分型的分析、数据库比对和比对结果的筛选。方法使用联合包含概率描述混合分型的识别力。利用联合被包含概率来估计被混合分型包含的样本的可靠性。结果混合分型的联合包含概率小于10~(-7)时具备入库比对的价值。混合分型单个基因座上能确定的等位基因大于等于2个时,增加一个额外等位基因,不会过多降低识别力。数据库检索获得多个无容差比中结果后,可以根据联合被包含概率来进行排序,快速找到最有价值样本。     

基于二代测序的混合检材精细化分型研究

目的基于二代测序平台进行混合检材精细化STR分型,并评估其法医学应用价值。方法收集性侵案件中3例混合检材及其比对样本,采用M48磁珠提取纯化试剂盒提取样本DNA,使用Foren SeqTM DNA Signature Prep试剂盒制备文库,Mi Seq FGx平台进行测序,Foren SeqTM Universal Analysis v1.2.1软件进行数据分析,将STR序列多态分型与长度多态分型进行比较。结果对3例混合检材STR分型进行拆分,在D3S1358、D13S317与D9S1122基因座发现存在同一长度多态等位基因包含两个个体的序列多态等位基因的情况。结论二代测序技术可对混合检材进行精细鉴别,为混合分型数据拆分提供更多线索和依据。     

国产Goldeneye~(TM) 20A试剂盒性能指标验证

目的测试国产GoldeneyeTM20A试剂盒技术性能指标,评估其法医学应用能力。方法从方法学验证、准确性、峰值均衡性、灵敏度、批次间试剂及稳定性测试、耐受性、不同检材的适应性与一致性、种属特异性、混合样本等9个方面对GoldeneyeTM20A试剂盒进行测试。结果阳性DNA样本分型正确,内标和等位基因分型标准物符合要求;等位基因间的均衡性≥83%,同一荧光标记基因座间的均衡性≥55%,不同标记物间的均衡性≥52%;0.125ng DNA阳性样本可检出全部STR基因座分型,不同批次间和反复冻融后试剂盒测试可以获得正确分型,对降解检材和混有抑制剂的样本等具有一定的耐受性,能对案件中多种检材进行分型且分型结果一致,具有一定的种属特异性和混合DNA样本检测能力。结论国产GoldeneyeTM 20A试剂盒可用于法庭科学实际检案与建库。     

两个体混合样本比例的PCR-STR检测研究

目的探讨PCR-STR检测两个体混合样本比例的灵敏度。方法按不同比例将两个体全血、单个核细胞及纯DNA 3种不同的样本进行混合,应用AB I公司生产的profile p lus商品化试剂盒多重PCR扩增后,用AB I3100基因分析仪进行毛细管电泳,检测基因座及其峰面积,并就混合样本中两单个核细胞样本DNA含量百分比与扩增前混合样本比例的关系进行相关分析。结果当样本混合比例为4%+96%时,可明确区分混合样本中两个体的基因型,且扩增前混合细胞百分率与扩增后两者峰面积比值呈直线相关。结论PCR-STR检测两个体混合样本比例的灵敏度有一定范围,并可进行半定量。     

基于高通量测序进行无创产前亲子鉴定的可行性

目的初步探讨基于高通量测序进行STR分型的技术方法应用于无创产前亲子鉴定的可行性。方法选择13个STR基因座(6个常染色体STR基因座,6个Y染色体STR基因座,1个性别判定基因座),进行复合PCR扩增和高通量测序文库构建后,采用Ion PGM400高通量测序平台进行测序,并采用自主研发软件NGS-STR genotyper(perl脚本)进行STR分型,本文简称上述过程为NGS-STR分型。对13个母子配对混合样本(母亲:儿子=2%~50%)、1组家系样本进行了上述NGS-STR分型,旨在(1)了解其在混合样本中的灵敏度及分型情况;(2)了解其在无创产前亲子鉴定中的应用可能性。结果 (1)当混合样本中低组分(儿子)的比例超过8%,所有基因座均可检出低组分的STR信息;(2)对1例血浆样本进行NGS-STR分型,共计69.2%的基因座可检出胎儿的STR基因型信息,且所有检出基因座均符合孟德尔遗传规律。结论初步证明了NGS-STR分型技术具有进行无创产前亲子鉴定的可行性。     

激光捕获显微分离技术分离多人混合精斑

目的利用激光捕获显微分离技术(LCM)分离多供体混合精斑。方法将3名自愿者供给的精液混合后,制备成混合精斑,并涂于覆膜玻片上。用PALM激光捕获显微分离系统切割并捕获样本中的单个精子,利用低体积扩增技术(LV-PCR)扩增并进行检测,并对分型结果进行统计。结果联用LCM和低体积扩增技术捕获样本中单个精子细胞进行扩增,可获得每位自愿者的Y-STR分型,分型成功率为73.15%。结论激光捕获显微分离联用低体积扩增技术可完成多供体混合精斑的分离检验。     

Goldeneye？DNA身份鉴定系统26Y试剂盒的法医学验证

目的：对Goldeneye？DNA身份鉴定系统26Y试剂盒的法医学参数进行验证和分析。方法根据DNA分析方法科学工作组（Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,SWGDAM）对试剂盒的法医学验证要求,从PCR扩增体系的测试、重复性、准确性、灵敏度等多个角度对该试剂盒进行检测评估。应用该试剂盒对华东地区517名汉族健康无关个体进行Y-STR基因座分型检测,检测单倍型分布状况及频率信息,并评估该试剂盒的法医学参数。结果该试剂盒对6.25μL扩增体系、DNA量低至125 pg时仍然可以得到准确的分型结果。特异性检测发现该试剂盒对常见的动物DNA和微生物DNA无有效的扩增结果。男性混合样本（1∶19和19∶1）中,较少样本的等位基因检出率可以达到70%以上;在男女混合样本中,女性DNA背景的存在不影响试剂盒的灵敏度。结论 Goldeneye？DNA身份鉴定系统26Y试剂盒灵敏度高、特异性好,且可以应用于混合物的检测。试剂盒所包含的26个Y-STR基因座多态性良好,可满足法医学实际应用。     

17个STR基因座快速多重扩增体系的建立及应用

目的建立17个STR基因座多重PCR快速扩增体系。方法采用人血样本提取DNA并定量,用于多重快速扩增体系分型准确性检测;采用标准品9948,设定稀释度,检测体系灵敏度;采用定量男女DNA样本按11种比例混合,检测体系对混合样本的分型能力;在标准品中加入干扰物质血红素和腐植酸,检测体系的抗干扰能力;对5种非人样本进行检测,评价体系的特异性;对实际案例进行检验,评价体系实际应用价值。结果采用本文体系,在65min内,用0.5~2ng DNA模板量能获得较好的扩增效果,分型结果准确稳定,扩增均衡;种属特异性好;血红素≤50μmol/L,腐植酸≤25ng/μL时可不受干扰准确分型;男女混合样本中单一样本量不低于1/10即可进准确进行判断;对实际案例常见生物检材的检验结果良好。结论本文17个STR基因座快速多重扩增体系可显著缩短扩增时间,技术性能符合实际检案要求,可在实践中选用。     

应用SNaPshot技术检测精液特异性cSNP遗传标记

目的 探讨基于SNaPshot技术的精液特异性编码区单核苷酸多态性（codingregionsinglenucleotidepolymorphism,cSNP）遗传标记检测在精液（斑）溯源及混合体液（斑）鉴定中的可行性。方法 制备16例精液斑和11例精液-静脉血混合斑样本,提取其基因组DNA(genomicDNA,gDNA)和总RNA,并将总RNA逆转录为互补DNA(complementaryDNA,cDNA)。在已验证的精液特异性mRNA编码基因上筛选cSNP遗传标记。基于SNaPshot技术构建cSNP复合检测体系并通过CE对样本进行基因分型。结果 成功构建了包含5个精液特异性cSNP的复合检测体系。在16例精液样本中,除了位于TGM4基因上的cSNP在cDNA的检测结果中出现等位基因丢失外,其余cSNP的gDNA和cDNA分型结果高度一致。检测精液-静脉血混合斑时,检出的cSNP分型结果均与精液提供者的基因型一致,未受到静脉血提供者基因型的干扰。结论应用SNaPshot技术检测精液特异性cSNP的方法可以应用于法医学精液（斑）的基因分型,并为混合体液（斑）中精液来源个体的判定提供...     

二组分混合DNA样品STR图谱解释

对混合样品STR图谱的结果进行解释。实验模拟二组分DNA混合样品 ,复合扩增荧光检测 10个基因座 ,比较混合样品谱带 ,计算等位基因峰面积比。结果发现 :二组分DNA混合样品的等位基因数增加 ,样品的混合比例不同就出现峰面积的不平衡。在等位基因峰面积比值与样品组分混合比例接近时 ,可由峰面积比值推断混合样品的混合比例。在混合比例为 1∶2 0时 ,基本上检测不到来自少量混合成分的等位基因 ,表现为单一组分图谱 ;在混合比例为 1∶10时 ,含量低的组分的等位基因峰面积接近与主要组分的“Stutter”峰面积 ,与来自主要组分的等位基因峰面积差异很明显。能检出混合样品中少量成分等位基因的最高混合比例为 1∶10     

毛干蛋白单氨基酸多态性鉴定研究

本文建立了毛干蛋白单氨基酸多态性（single amino acid polymorphism,SAP）的质谱检测方法，以DNA测序验证方法的准确性，并设计多组样本检验SAP鉴定的重现性。对来自6个人的25份毛干样本的SAP鉴定结果进行分析，并与毛干来源人的血液外显子测序结果相比较，对于不一致位点进一步使用Sanger法测序确定SAP对应的SNP分型。共设计四组重复性实验测试，对不同直径/生长部位毛干的分型结果进行了一致性验证。通过设计的376对引物进行PCR扩增，成功检测了522个SNP分型，其中32个（6.1%）与前期外显子测序分型不一致，152个（29.1%）为外显子测序中未检测的分型，338个（64.8%）与外显子分型结果一致。四组重复性实验中，组内SAP鉴定准确率平均值为93.6%(95%CI:92.8%～94.5%)，鉴定重现率平均值为96.0%(95%CI:94.3%～97.6%)。在所有25份样本中，有283个SAP位点在至少两个样本中检出，其中23个位点在全部样本中都被检出。因此，毛干蛋白SAP鉴定方法具有较高的准确性和重现性，得到的23个高检出率SAP位点可作为候选...     

多个Y-STR基因座等位基因缺失分析

目的探讨多个Y-STR基因座等位基因分型缺失原因,为法医学实践提供基础数据。方法使用Yfilerplatinum试剂盒对4份样本进行Y-STR分型检测,并使用Y-pathfinder试剂盒进行复核验证,同时常染色体STR分型检测。结果 1号样本含Amel-Y在内10个基因座分型缺失,其在染色体上的位置在6.86-8.78Mb之间;2号样本在DYS385a/b等15个基因座分型缺失,其在染色体上的位置在18.63-25.93Mb;3号样本在DYS533等4个基因座分型缺失,其在染色体上的位置在16.28-17.11Mb;4号样本在DYS387S1a/b等6个基因座分型缺失,其在染色体上的位置在23.78-25.93Mb。2、3、4号样本Amel-Y等位基因分型正常。4个样本分属单倍型类群I2a,G2a,O3,L。结论 4份样本Y染色体多个等位基因缺失STR基因座紧密相连,可能系染色体片段微缺失所致;Y-STR基因座分型缺失存在多样性,在法医工作中应该引起重视。     

混合生物样品的组分分析及其STR基因型判定

目的应用荧光标记STR多基因座联合检测技术对混合生物样品较少组分最低比例检出限和STR基因型的判定进行研究。方法 将已知浓度的人标准细胞系DNA:9947A和K562分别按照1:1、1:4、1:9、1:19、1:39、1:59、1:79和1:99比例混合后作为扩增模板,应用Profiler plus试剂盒对D3S1358、VWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820和性别鉴定基因座检验。结果在比例为1:19时能明确判定两个体各基因座基因型,且两样品基因型结果峰高平均值之比与样品浓度之比正相关。结论应用荧光标记STR多基因座联合检测技术可以对一定比例的混合生物样品进行STR基因型判定,并对其混合比例状况进行大致推断。