新型鸡痘病毒穿梭载体的构建及其体外表达

为构建用于筛选的新型鸡痘病毒载体,采用染色体步移技术对鸡痘病毒282E4株TK基因的下游序列进行测序,并结合扩增出的左右同源重组臂TKL、TKR片段、启动子、MCS及终止信号构建出三表达盒穿梭载体pTKE3。采用基因工程技术将绿色荧光蛋白EGFP基因克隆入3个启动子的下游,构建出pTKE3-A、pTKE3-B、pTKE3-C验证表达盒质粒。结果显示,构建的3个验证质粒分别与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞,均可在转染12h后观察到绿色荧光。结果表明,构建的三表达盒载体均可成功表达外源基因,这为进一步构建多价重组鸡痘病毒活载体疫苗奠定了基础。     

鸡痘病毒自然分离株的某些特性

鸡痘病毒自然分离株的某些特性徐春厚吴凌房秀云邵红程葛（黑龙江八一农垦大学动物科技学院密山１５８３０８）鸡胚的绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）已广泛用于分离和增殖鸡痘病毒，在ＣＡＭ上鸡痘病毒可形成痘斑和嗜酸性包涵体。作者于１９９５年从牡丹江地区某种鸡场发病鸡群的鸡...     

表达鸡白细胞介素1β基因重组鸡痘病毒的构建

从伴刀豆球蛋白 (ConA)刺激的鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素 1β(ChIL 1β)编码区基因 ,通过与GenBank上登录的ChIL 1β序列 (Y15 0 0 6 )进行比较。结果显示 ,在ChIL 1β基因编码区的 10 4位、30 6位、387位和 4 32位的核苷酸发生了变化 ;相应的氨基酸在 35位也发生了变化。虽然 30 6位、387位和 4 32位的核苷酸发生了变化 ,但没有引起氨基酸变化 ,说明这一区域的氨基酸具有一定的保守性。从氨基酸的性质上看 ,35位 (Asp→Ala)由酸性氨基酸变为中性氨基酸 ,这可能是同一种属的不同品种间的正常变化。以鸡痘病毒 (FPV )为活载体 ,构建了表达ChIL 1β的重组鸡痘病毒rFPV IL 1β。应用XTT/PMS方法检测rFPV IL 1β感染的成纤维细胞 72h后表达ChIL 1β的生物活性 ,效价为 1.0× 10 5U /mL ,证明FPV能有效地表达ChIL 1β。     

表达MDV-gB基因的重组鸡痘病毒免疫效果观察

将马立克氏病病毒 (MDV ) gB基因插入鸡痘病毒中 ,构建了含有MDV gB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV ) ,用rFPV、火鸡疱疹病毒 (HVT)冻干疫苗、rFPV HVT二联疫苗分别免疫 1日龄AA肉用雏鸡 ,8日龄攻毒后观察免疫保护效果。结果表明 ,3种疫苗均诱导了免疫应答 ,免疫保护率分别为 69%、69%和 85 %。该重组病毒疫苗的免疫效果与HVT疫苗的免疫效果相当 ,二者联用具有免疫协同作用。     

用间接ELISA法检测鸡痘病毒抗体的研究

建立了检测鸡痘病毒抗体的间接ELISA方法 ,用该法检测 2 0份人工感染鸡血清样品 ,抗体阳性率为 10 0 % ,康复期鸡群血清抗体阳性率为 4 3% ,人工接种弱毒疫苗 6 5d和 170d鸡群血清抗体的阳性率分别为 6 0 %、70 %。经反复试验 ,确定了诊断抗原的制备方法和间接ELISA检测鸡痘抗体的最佳反应条件 ,即抗原包被浓度 10 .8μg/孔 ,待测血清最佳稀释度为 1∶10 0。     

重组鸡痘病毒rFPV-VP3-F的遗传稳定性及在鸡体内的表达

为了评价重组禽痘病毒rFPV-VP3-F的遗传稳定性,将rFPV-VP3-F在鸡胚成纤维细胞(CEF)连续培养20代.对第5、10、15和20代病毒的F基因进行扩增及序列分析,未发现F基因发生氨基酸改变;通过间接免疫荧光方法检测各个代次rFPV-VP3-F中F基因特异表达的情况;将rFPV-VP3-F和禽痘病毒FPV017分别接种于35日龄商品鸡,在免疫后第7、14、21、28、35 d采集各组血清,检测中和抗体效价.结果显示,F基因在重组禽痘病毒中可以稳定遗传,可在CEF中表达相应蛋白,可刺激鸡产生相应的抗体.     

鸡IFN-γ重组鸡痘病毒对鸡传染性腔上囊炎MB43弱毒疫苗免疫鸡免疫应答的影响

将重组鸡痘病毒(rFPV-IFN-γ)与IBD MB43弱毒疫苗联合接种SPF鸡,研究重组鸡IFN-γ对IBD疫苗免疫效果的影响.结果显示,rFPV-IFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组(MB43+rFPV-IFN-γ)及rIFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组(MB43+rIFN-γ)在免疫后第2周即可检出ELISA抗体,比MB43疫苗单独免疫组早1周.用IBDV Gx株攻击后,MB43+rFPV-IFN-γ组和MB43+rIFN-γ组免疫鸡的脾只有个别淋巴细胞核浓缩、核崩解,少数滤泡萎缩变性坏死;胸腺损伤程度轻于MB43疫苗单独免疫组和非免疫对照组.免疫后1周,3个免疫组外周血CD8+T淋巴细胞含量均显著高于非免疫对照组,CD4+T淋巴细胞含量变化不明显;攻毒后第2周,3个疫苗免疫组CD4+、CD8+T淋巴细胞含量均显著升高,各组之间CD4+、CD8+T淋巴细胞含量无明显差异.证实,rFPV-IFN-γ和rIFN-γ可加强疫苗的细胞免疫和体液免疫应答.     

一起麻鸡鸡痘病毒与巴氏杆菌混合感染病例的诊断

为了对2011年10月长春市某鸡场的150多只60日龄麻鸡发生急性死亡,病死鸡在临床上出现食欲不振、精神委靡,鸡冠以及背部皮肤有结节状痘疹以及排黄绿色稀粪等临床症状的疾病进行确诊,通过细菌学检查、病毒分离鉴定、动物回归试验以及病理组织学观察等方法从病原学和病理学角度进行了系统的分析。病死鸡肝触片可见有典型的两极浓染的短杆菌;应用鸡痘病毒4b核心蛋白基因特异性引物的扩增结果为阳性;将痘疹病料处理上清液经尿囊绒毛膜途径接种9日龄SPF鸡胚,接种后第7天可见尿囊膜上形成有灰白色突起的痘斑;皮肤痘疹研磨处理上清液经电镜负染观察可见典型的痘病毒粒子。病理组织学观察结果表明,局部肝细胞发生变性、坏死,并伴有多量的异嗜性粒细胞浸润。根据上述实验室检测结果并结合临床症状进行综合分析,确诊该起病例为鸡痘病毒与巴氏杆菌混合感染所致。     

新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的安全性及免疫效力

将重组鸡痘病毒rFPVLP-SF分别皮下接种1日龄SPF鸡和26日龄商品鸡,评价其安全性和免疫效力.SPF鸡接种后除282E4株鸡痘病毒组在接种部位出现痘斑外,其他组鸡无任何临床症状.抗体检测结果表明,免疫接种后rFPVLP-SF组鸡的血清抗体水平没有显著变化,免疫后第21 d以1×105ELD50的F48E8株NDV滴鼻攻毒,观察14 d,rFPVLP-SF和油乳剂灭活疫苗免疫鸡的保护率分别为92%和100%,二者没有显著差异;大空斑株鸡痘病毒组和攻毒对照组鸡均全部死亡.结果显示,该重组病毒具有良好的安全性和免疫效力,有一定的应用前景.     

转基因鸡研究进展

转基因鸡研究进展扈荣良，殷震（解放军农牧大学军事兽医研究所长春１３００１２）自１９８１年“巨型小鼠”问世以来，采用显微注射等基因导入手段，相继培育获得家兔、猪、羊、牛及鱼类等转基因动物，它们在家畜育种、人类疾病、医药生产、免疫以及遗传等研究方面都产生...     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒转移载体的构建

从含有鹅细小病毒 (GPV)H1株主要结构蛋白VP3基因的重组质粒pPROEXHTb VP3中切取GPVH 1株VP3基因片段 ,将其亚克隆于 pSY5 3 8的EcoRⅠ位点 ,并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaⅠ位点 ,再用NotⅠ切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段 ,亚克隆于pSY681的NotⅠ位点 ,构建了含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体。上述结果为GPV基因工程疫苗的研制奠定了基础     

鸡痘病毒282F_4弱毒株基因组BamHⅠ片段的克隆与分析

采用鸟枪法克隆鸡痘病毒（Ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ，ＦＰＶ）基因组ＢａｍＨⅠ部分片段，用Ｔｈｇｏｘｉｇｅｎｉｎ一ｄＵＴＰ标记的ＦＰＶ２８２Ｆ_４弱毒株ＢａｍＨⅠ片段探针，点杂交，证实２２个克隆插入了ＦＰＶ２８２Ｅ_４弱毒抹ＤＮＡ的ＢａｍＨⅠ片段，选取具有代表性的大小不同的６个质粒ｐＵＡ、ｎＵＢ、ｐＵＣ、ｐＵＤ、ｐＵＥ、ｐＵＦ。６个质粒插入的片段Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ分别为７．３，４．９．４．２，３．６，３．２，３．０ｋｂ，分别以ＣｌａⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄⅡ、ＰｓｔⅠ、ＳａｃⅠ、ＳａｃⅠ、ＳｍａⅠ、ＸｈｏⅠ进行单酶切，又经适当组合酶切。实验结果表明，在各片段在在的单酶切位点为Ａ：ＥｃｏＲⅠ、ＳａｃⅠ、ＸｈⅠ位点；Ｂ：ＥｃｏＲⅠ、ＸｈⅠ、ＨｉｎｄⅡ位点；Ｃ：ＣｌａⅠ、ＳａｃⅠ、ＳａｌⅠ位点；Ｄ：ＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ位点；Ｅ：ＥｃｏＲＶ位点；Ｆ：ＥｃｏＲＶ位点。逃出７．３ｋｂ片段，选取片段中单一酶切位点ＢｇｌⅡ，插入痘苗病毒（ｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓ，ｖｖ）Ｐ_７，５启动于和Ｐ_１１启动子控制下的报告基因ＬａｃＺ，构建成时时表达载体质粒，通过与ＦＰＶ２８２Ｅ_４株转染鸡胚成纤维细胞，一生的重组病毒，可以表     

重组鸡痘病毒首免与灭活疫苗加强免疫对高致病性禽流感免疫效果的影响

用表达H5亚型禽流感病毒(AIV)HA与NA基因的重组鸡痘病毒(rFPV)rFPV-12LSH5NA对10日龄带有H5亚型AIV母源抗体的商品鸡进行了首次免疫,17日龄时再用H5亚型AIV全病毒灭活疫苗加强免疫.免疫鸡分为2个批次,分别在24和31日龄用H5亚型AIV进行致死性攻击.在24日龄攻毒组中,rFPV首免与全病毒灭活疫苗加强免疫组的死亡比例(0/17)显著低于17日龄全病毒灭活疫苗单独免疫组(16/17).在31日龄攻毒组中,rFPV首免与全病毒灭活疫苗加强免疫组的死亡比例(0/17)显著低于10日龄rFPV单独免疫组(6/17).结果显示,在鸡群普遍存在针对H5亚型AIV母源抗体的情况下,rFPV首免与全病毒灭活疫苗配合使用能使鸡体快速建立坚强的免疫保护反应,是一种非常有效的免疫策略.     

鸡传染性法氏囊病研究进展

(一)病原学 1.分类:鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的分类地位目前尚有争论,有以下几种不同的分类报道:小核糖核酸病毒科(Cho, 1969, Lunger, 1972),腺病毒科(Almei     

鸡传染性贫血的研究进展

鸡传染性贫血 (Chickeninfectiousanemia)是由鸡传染性贫血病毒 (Chickeninfectiousanemiavirus ,CIAV)引起的 ,以贫血、胸腺萎缩、骨髓黄化、造血机能障碍和免疫机能损害为特征的传染病。 1979年Yuasa等[1] 在日本首次分离到CIAV (Gifu 1株 )。最初定名为鸡贫血因子 (CAA)。目前已发现该病毒广泛分布于主要家禽生产国家 ,如日本、美国、澳大利亚、新西兰及欧洲、南美洲一些国家[2 ] 。我国于1992年首次分离到该病毒[3] ,随后相继从黑龙江、山东、辽宁、吉林等地的鸡群中分离到野毒株。根据近几年的流行病学调查 ,CIAV在我国鸡群中…     

马立克氏病病毒gB基因的克隆及重组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒 (MDV) 2 .8kbgB基因 ,并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ酶切位点。然后用PstⅠ /NotⅠ酶切回收 gB片段 ,插入到转移载体 pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ /NotⅠ酶切位点处 ,构建了转移质粒pEFgpt12s gB。将该质粒与鸡痘病毒 (FPV)野毒 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过MXHAT选择培养基进行筛选 ,蚀斑纯化 ,经PCR扩增证实重组病毒中含有 gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别 ,病毒效价分别为 10 -5.43 TCID50 /mL和 10 -6TCID50 /mL ,表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性     

重组鸡痘病毒表达的鸡IL-1β和IL-2以及cMGF对新城疫LaSota疫苗免疫效果的影响

将128只10日龄SPF鸡随机分成8组,每只免疫1 PD_(50)的新城疫LaSota疫苗；同时Ⅰ～Ⅵ组鸡分别皮下注射不同剂量的重组鸡痘病毒rFPV-IL-1β、rFPV-IL-2或cMGF,而Ⅶ组和Ⅷ组鸡分别皮下注射鸡痘病毒wt-FPV和PBS作为阴性对照和空白对照。结果,重组鸡痘病毒表达的IL-1β、IL-2或cMGF可以消除鸡痘病毒在免疫后第7d对雏鸡体重增长的影响；一定剂量的IL-1β和IL-2可使鸡脾中CD4~ T细胞在免疫后第7d和CD8~ T细胞在免疫后第14d的总体水平提高；免疫第21d新城疫F48E8强毒攻毒后,一定剂量的IL-1β和IL-2能提高免疫保护率,而cMGF却无此作用。结果表明,重组鸡痘病毒表达的IL-1β和IL-2在一定剂量下可增强新城疫LaSota疫苗的免疫效果。     

表达基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选

为了构建并筛选表达新城疫病毒(NDV)F蛋白的重组鸡痘病毒(rFPV-F),通过PCR扩增F基因,克隆至pMD18-T Simple载体,进行DNA序列分析和遗传进化关系分析。将测序正确的F基因克隆至笔者所在实验室自行构建的新型鸡痘病毒穿梭载体pTS2GFPV150中,获得重组质粒pTS2GFPV150-F。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染鸡胚成纤维细胞进行同源重组,挑取表达增强型绿色荧光蛋白的噬斑,经多轮筛选获得重组病毒rFPV-F,应用PCR、RT-PCR、Western-blot等方法对重组鸡痘病毒进行鉴定。结果显示,成功获得NDV F基因及重组F基因的鸡痘病毒rFPV-F,并证实F基因已被整合到鸡痘病毒基因组中,且在感染细胞内被成功表达。本研究成功获得了1株表达NDV F基因的重组鸡痘病毒,为下一步开展动物体内免疫研究奠定了基础。     

鸡呼肠孤病毒性关节炎研究进展

(一)病原 鸡呼肠孤病毒性关节炎是由禽呼肠孤病毒引起鸡的一种重要的传染性疾病。该病首先是在肉型鸡中发现的,Olson等(1957)从一只野外病例中首次分离到该病毒。Schwartz等(1976)首次报道了蛋鸡的本病。Page等(1982)首次报道了火鸡的本病。     

鸡淋巴细胞性白血病的研究进展

鸡淋巴细胞性白血病的研究进展甘永华（解放军农牧大学兽医学院长春１３００６２）自１８６８年Ｒｏｌｏｆ报道第一例鸡淋巴肉瘤以来，白血病已分布于世界各地。白血病是多种肿瘤性疾病的统称，其中以淋巴细胞性白血病多见。淋巴细胞性白血病是由淋巴细胞性白血病病毒（ｌ...