布鲁氏菌延胡索酸水合酶与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原的结合活性

依据牛型布鲁氏菌(Brucella abortus)延胡索酸水合酶(fumarate hydratase classⅠ,Fumhy)基因序列设计1对特异性引物,以牛型布鲁氏菌A19株基因组为模板,通过PCR扩增Fumhy基因的开放阅读框,连接到pMD18-T Simple载体上后进行序列测定和分析;将Fumhy定向克隆到表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-Fumhy,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下,进行Fumhy蛋白的表达,对表达的Fumhy蛋白进行免疫原性、与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性检测,研究Fumhy蛋白的免疫原性及相关的生物学活性。测序结果表明,Fumhy基因全长1 620bp,编码539个氨基酸;成功获得带有His标签的Fumhy重组蛋白His-Fumhy,大小为59ku,与预期结果相符合。Western-blot检测结果表明Fumhy蛋白具有免疫原性,且具有与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性。由此推测Fumhy蛋白可能参与布鲁氏菌在体内的感染过程。     

牛型布鲁氏菌A19株外膜蛋白OMP2b的表达及鉴定

根据GenBank中的牛型布鲁氏菌基因序列,设计了1对特异性引物,以A19菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出外膜蛋白OMP2b的全长基因,将OMP2b经T-A克隆后进行了序列测定和分析。结果表明,OMP2b全长1 128bp,编码376个氨基酸。将OMP2b定向克隆至表达载体pCold TF中,构建重组表达质粒pCold TF-OMP2b,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白His-OMP2b。SDS-PAGE分析结果显示,His-OMP2b约为93ku,与预期大小一致,表明His-OMP2b表达成功;经Wes-tern-blot分析,His-OMP2b能与牛型布鲁氏菌A19株全菌兔抗血清发生特异性反应,表明His-OMP2b具有免疫反应性。     

重组鹅IFN-α蛋白在内含肽-冷激诱导表达系统中的表达

为了在大肠杆菌系统中高效表达具有抗病毒活性的重组鹅IFN-α(GoIFN-α)蛋白,在GoIFN-α基因上游融合内含肽Ssp Dnabmini-intein(SDI)序列,然后克隆至pET-43.1a(+)载体中,再将获得的pET-43.1a(+)-SDI-GoIFN-α重组载体和pColdⅢ载体分别进行双酶切,构建内含肽-冷激表达载体pColdⅢ-Nu-sA-SDI-GoIFN-α,将重组载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG低温诱导表达。结果表明,融合基因获得高效表达,表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。表达产物经Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经CGBQ-GPMV系统检测,证实表达的融合蛋白具有生物学活性,为后续的纯化工作和研究具有天然活性的重组鹅IFN-α奠定了基础。     

牛型布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆与原核表达

采用PCR技术从河北省某牛场流产污物中扩增得到布鲁氏菌外膜蛋白(OMP31)基因,将其连接入pMD18-T克隆质粒并进行序列测定;测序正确后,将该基因插入pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞,诱导表达融合蛋白,并用Western-blot分析表达蛋白的免疫反应特性。结果显示,扩增了OMP31的全基因,基因全长723bp,共编码241个氨基酸。成功构建了布鲁氏菌OMP31基因的原核表达载体pET-OMP31,并且在大肠杆菌中表达了OMP31蛋白,经Western-blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应。证实布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因已成功表达,为布鲁氏菌病血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研究提供了基础资料。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ3毒株N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)BJ3毒株N蛋白及制备抗N蛋白单克隆抗体,将N基因克隆至原核表达载体pColdⅠ,利用大肠杆菌BL21表达出了N蛋白。将IPTG诱导的细菌反复冻融3次后超声裂解,离心后分别收集上清和沉淀,用镍柱亲和层析分别纯化,SDS-PAGE结果显示,N蛋白主要以包涵体的形式存在。用纯化的N蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,3次亚克隆后获取1株PRRSV N单抗,命名为F4。F4可与大肠杆菌BL21、不同PRRSV分离株表达的N蛋白发生特异性反应。本试验为进一步研究N蛋白的结构、功能及建立快速诊断PRRSV方法奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ3毒株N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）BJ3 毒株N蛋白及制备抗N蛋白单克隆抗体,将N基因克隆至原核表达载体pCold I,利用大肠杆菌BL21表达出了N蛋白。将IPTG诱导的细菌反复冻融3次后超声裂解,离心后分别收集上清和沉淀,用镍柱亲和层析分别纯化,SDS-PAGE结果显示,N蛋白主要以包涵体的形式存在。用纯化的N蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,3次亚克隆后获取1株PRRSV N单抗,命名为F4。F4可与大肠杆菌BL21、不同PRRSV分离株表达的N蛋白发生特异性反应。本试验为进一步研究N蛋白的结构、功能及建立快速诊断PRRSV方法奠定了基础。     

弓形虫硫氧还蛋白样蛋白基因的克隆与原核表达

为掌握刚地弓形虫硫氧还蛋白样蛋白(thioredoxin-like,TRXL)的生物学特性及其作为诊断候选分子的潜力,针对trxl基因序列设计引物,通过RT-PCR法扩增弓形虫trxl基因,并将其连接至pET-30a(+)原核表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,分析了rTRXL蛋白的反应原性。结果显示,弓形虫trxl基因全长1 275bp,共编码424个氨基酸,与GenBank中下载的弓形虫ME49株trxl基因的参考序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,诱导表达的重组蛋白rTRXL的大小约48ku,与预期的结果相符,主要以包涵体形式存在。Western-blot结果显示,重组蛋白rTRXL能被感染弓形虫的猪阳性血清识别,表明重组蛋白rTRXL具有良好的反应原性。上述研究结果为弓形虫rTRXL蛋白作为新型弓形虫诊断试剂候选抗原的研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(fnbA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了3 600bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pGEM T easy载体中,成功地构建了克隆质粒pGEM-fnbA。以HindⅢ和XhoⅠ双酶切pGEM-fnbA和pET28a( ),将纯化的基因fnbA亚克隆至pET28a( )中,构建了原核表达质粒pET28a-fnbA,并将其转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约165 ku处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带。Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。     

伪狂犬病病毒UL36蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

伪狂犬病病毒UL36基因编码的皮层蛋白VP1/2在病毒粒子组装过程中发挥重要作用。本试验以UL36基因为研究对象,将截短的UL36基因克隆入载体pCold I,构建了重组原核表达质粒pCold I-UL36。经诱导表达,将包涵体形式表达的重组蛋白经过变性、亲和层析及复性后获得了纯度较高的蛋白。将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合和间接ELISA方法筛选出1株能稳定分泌针对UL36蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,被命名为UL36-6,抗体亚型鉴定结果为Ig G1和κ,制备的腹水抗体中和效价及纯度高,Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明单克隆抗体具有很好的特异性。综上所述,本研究成功制备出1株针对PRV UL36蛋白的单克隆抗体,为深入研究UL36蛋白的生物学功能奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒PP62蛋白在昆虫细胞中的表达与鉴定

为表达非洲猪瘟病毒PP62蛋白,将非洲猪瘟病毒pp62基因克隆至pFastBac-HTA载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒rBac-pp62。将该重组病毒感染Sf9细胞后,采用间接免疫荧光(IFA)检测PP62蛋白的表达,通过亲和层析纯化重组蛋白PP62,以Western-blot和间接ELISA方法鉴定纯化的重组蛋白PP62的免疫反应活性。结果显示,重组杆状病毒rBac-pp62感染的Sf9细胞可以大量表达PP62蛋白,纯化的PP62重组蛋白能够与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应,以重组蛋白PP62为包被抗原建立的间接ELISA方法可以区分非洲猪瘟阳性血清和阴性血清。结果表明,表达的重组蛋白PP62具有良好的反应活性,可作为开发非洲猪瘟抗体检测试剂盒的抗原以及用于PP62蛋白的结构和生物学功能研究。     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。     

布鲁氏菌pcDNA3.1-omp17.3基因疫苗的研制

采用PCR方法扩增了布鲁氏菌17.3 ku外膜蛋白编码基因,并将该基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-omp17.3。pcDNA3.1-omp17.3转染COS-7细胞后,通过Western-blotting检测到了17.3 ku蛋白的瞬时表达。将pcDNA3.1-omp17.3免疫小鼠,三免后经ELISA、流式细胞仪以及ELISPOT技术检测到pcDNA3.1-omp17.3在小鼠体内诱导产生了以Th1型为主的细胞免疫应答。结果表明,构建的基因疫苗可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗,有进一步研究的意义。     

非洲马瘟病毒VP7基因在重组杆状病毒中的表达及抗原性检测

利用pFastBacHTA质粒将非洲马瘟病毒(AHSV)血清4型的VP7基因重组入杆状病毒,并感染昆虫细胞Sf9。结果显示,VP7蛋白在真核细胞内获得了表达,但表达量较低。免疫印迹试验证实,VP7重组蛋白具有较好的免疫原性,将其作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测AHSV的间接酶联免疫吸附试验方法。     

口蹄疫病毒3B基因的高效表达及其表达产物的反应活性

通过PCR技术获得口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因,将其克隆至质粒pET-32a( )和高效可溶性表达质粒pEM中,经PCR筛选,获得阳性重组子pET-3B和pEM-3B,将它们转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot检测结果证明,表达的3B融合蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应。蛋白可溶性分析表明,EM-3B融合蛋白绝大部分以可溶形式表达。以此可溶性融合蛋白EM-3B为抗原建立了可区分FMD免疫动物和感染动物的EM-3B-DIVA-ELISA方法,经检测,其特异性为95.0%,敏感性为97.5%,与2个国产试剂盒的符合率分别为96.25%和98.75%。     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

密码子优化对鸭坦布苏病毒E基因DNA疫苗免疫应答的增强作用

为提高DNA疫苗用于预防鸭坦布苏病毒病的免疫原性,将鸭坦布苏病毒的E基因密码子改造为鸭偏嗜的密码子,并将其作为免疫原基因克隆到pCAGGS载体中,构建真核表达质粒pCAGGS-OptiE。将pCAGGS-OptiE和先前构建的编码野生型E基因的表达质粒pCAGGS-E分别转染293T细胞,用间接免疫荧光和Western-blot检测E蛋白的表达情况。结果显示,密码子优化的重组质粒的蛋白表达量明显高于野生型质粒。将重组质粒pCAGGS-OptiE和pCAGGS-E用脂质体包裹后分别尾静脉注射免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测抗体的产生情况。结果显示,质粒pCAGGS-OptiE诱导的抗体水平明显高于pCAGGS-E,表明密码子优化的E基因能够提高蛋白的表达水平,进而增强机体免疫应答反应。     

猪囊尾蚴T24基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因,将扩增产物与pGEM-T easy载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting;用所表达的蛋白免疫小鼠,经ELISA检测血清抗体,验证其免疫原性。结果显示。所克隆的T24基因片段长716 bp。含有1个678 bp的开放阅读框,其编码226个氨基酸,与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100％;表达的融合蛋白大小为40 ku,并能被猪囊虫阳性血清识别;免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体,第30 d达到较高水平,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。     

犬瘟热病毒R/20-8株核衣壳蛋白基因的克隆和表达

应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒(CDV)核衣壳(N)蛋白基因的高度保守序列,将其克隆至质粒pMD18-T中,获得了重组质粒pMD18-T-N。将N基因的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE电泳和Western-blot分析结果显示,表达产物的分子质量为55 ku,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。表明,大肠杆菌表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有一定的相似性,可作为诊断用抗原。     

寨卡病毒NS1蛋白在杆状病毒系统中的表达及免疫原性分析

本研究旨在采用杆状病毒表达系统表达并纯化寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)NS1蛋白,并对其免疫原性进行鉴定。将ZIKV NS1基因克隆至杆状病毒载体pFastBac1中,构建重组转移载体,将其转化DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒,经SDSPAGE和Western-blot鉴定蛋白正确表达后,将其感染High5细胞,大量表达重组蛋白,并用镍柱亲和层析法进行纯化,将纯化后的ZIKV NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,进行血清特异性抗体效价检测。最终结果显示,获得了纯度较高分泌表达的ZIKV NS1蛋白,并且血清特异性抗体效价实验表明,纯化的ZIKV NS1蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,有很好的免疫原性。本研究为ZIKV疫苗和诊断试剂盒的研发奠定了重要的基础。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H重组亚单位疫苗对小鼠的免疫保护效果

为分析牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的免疫保护效果,将纯化的牦牛源多杀性巴氏杆菌重组外膜蛋白H(rOmpH)制备成疫苗,用该重组疫苗和全菌灭活疫苗皮下免疫小鼠。首免后每周采血1次,用间接ELISA方法检测其抗体动态变化,并于三免后第9天用2LD50的分离株进行攻毒,比较两者的保护力。结果显示,全菌灭活疫苗组小鼠30h后死亡率为20%,重组疫苗组小鼠30h后100%死亡,PBS对照组小鼠24h后100%死亡。结果表明,全菌灭活疫苗具有保护力,而重组蛋白疫苗保护性微弱。