犬瘟热病毒小熊猫株的驯化致弱及其免疫研究

犬瘟热病毒(CDV)小熊猫低代强毒(LPV9)经MDCK、CRFK和Vero细胞分别传至21、20、20代,并采用蚀斑技术对传代毒进行克隆.病毒每传20代进行1次致弱程度鉴定,结果表明LPV9随所传代数增加,对幼犬的致病性逐渐减弱,至第70代(LPV70)时,对接种犬失去了致病性.2个组犬按每只1×104TCID50,分别接种LPV70和疫苗弱毒复壮株R-20/8,14 d后前者刺激接种幼犬产生的中和抗体效价均大于1100的完全保护价,而后者则有低于1100的(攻毒保护率分别为5/5和4/5),故驯化致弱的LPV70免疫原性要好于疫苗弱毒复壮株R-20/8.将LPV70分别在细胞上连续20代、在幼犬连续传代5代后,其细胞培养物及从动物体内回收的病毒免疫原性及安全性能够稳定遗传.     

犬Ⅱ型腺病毒的分离鉴定

在做犬腺病毒分子流行病学调查的过程中,从送检的犬粪便中分离出多株犬腺病毒,并对其中１ 株进行了系统鉴定。经形态学、理化学、血清学交叉中和试验、动物感染试验与分子生物学鉴定,证明为１ 株犬传染性喉气管炎病毒的强毒,即犬Ⅱ型腺病毒。     

感染性分子克隆衍生的马传染性贫血病毒的免疫学特性

将马传染性贫血病毒驴白细胞毒疫苗(DLA EIAV)、DLA EIAV感染性分子克隆衍生毒(vOK8226)以及强弱毒嵌合毒(vOKVltr)分别接种健康马,并于接种后第 220 d,用 EIAV强毒辽宁株(L EIAV)攻击,观察临床变化,并测定接种后各结构蛋白的抗体变化。结果发现,攻毒后,2匹非免疫对照马和克隆衍生毒接种组中的 1 匹马体温均出现典型的稽留热并死亡,死亡马呈现典型的马传染性贫血的病理组织学变化,其他免疫马未见任何临床变化;在攻毒后第 450 d剖杀所有存活马,也未见任何病理组织学变化。抗体检测结果表明,免疫接种后攻毒前各组 p11 和 p9 抗体均检测不到,嵌合毒接种组p15、p26和gp45抗体水平高于其他组。攻毒后非免疫对照马体内抗p9、p11、p15、p26和 gp45抗体均显著升高,并持续至死亡;嵌合病毒接种马体内各结构蛋白抗体水平与攻毒前没有显著变化,克隆衍生毒接种马体内各结构蛋白抗体水平比攻毒前有所升高。通过临床观察、病理组织学检测以及攻毒后各结构蛋白抗体记忆反应情况分析,置换了强毒 LTR 的DLA EIAV感染性分子克隆衍生毒(强弱毒嵌合病毒)免疫马能够抵抗马传染性贫血病毒强毒的攻击,获得完全保护,而DLA EIAV感染性分子克隆衍生毒免疫马未能完全抵抗强毒的攻击。     

聚合酶链反应检测猪细小病毒的研究

利用聚合酶链反应(PCR),对从猪细小病毒(PPV)三株强毒及 两株弱毒的细胞培养产物中提取的核酸进行扩增。通过琼脂糖电泳,均得到了约158bp(碱基对)的特异性核酸片段。与该病毒本身的二个含20bp的寡核苷酸引物之间的核酸长度相等。而对与PPV具有基因同源性的犬细小病毒(CPV)及与PPV临床症状相似的非相关病毒如日本乙型脑炎病毒(JEV)、伪狂犬病毒(PRV)作同样处理,未得到核酸带。并且通过筛选裂解蛋白的方法,建立了一种快速提取DNA的方法,初步制定了快速检测PPV的程序。     

犬腺病毒1型感染普通级比格犬中Ⅰ和Ⅲ型干扰素及其受体分子表达量的比较

比较普通级比格犬感染犬腺病毒1型(CAV-1)后外周血和肝内Ⅰ型和Ⅲ型干扰素(IFN)及其受体分子的转录水平,同时评估CAV-2疫苗免疫对CAV-1感染试验的影响.对3只2月龄普通级比格犬后肢肌肉注射1057TCID50CAV-1纯化病毒,在攻毒后12 d内记录体温变化,每日采集咽拭子和肛拭子,于攻毒后第3、6、9、1...     

牛病毒性腹泻弱毒活疫苗的安全性和免疫保护效果研究

为评价牛病毒性腹泻病毒弱毒株的安全性及其免疫保护效果,将致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)驯化培养,接种MDBK细胞,优化病毒增殖条件,并将其免疫牛,评价其安全性及免疫保护效果。结果显示,优化后的病毒效价可达107.5TCID50/mL。动物试验结果显示,1月龄牛接种该弱毒株后,体温正常,白细胞数量没有下降,无任何临床异常表现。免疫牛用BVDV强毒株进行攻毒;结果表明,免疫保护效果良好。表明该毒株可以作为弱毒活疫苗研究的候选毒株。     

新疆部分地区犬肠道蠕虫感染情况调查

为了开展包虫病的综合防制,我们利用氢溴酸槟榔碱测试法,对新疆部分地区农牧团场家(牧)犬进行了泻下检查,以了解家(牧)犬肠道蠕虫的感染情况,现将1986年7月至1992年5月的调查结果报告如下。 材料与方法 (一)调查犬的种类 本调查包括全疆17个县市分布的22个农牧团场,共计1659条犬。犬年龄范围值为3月龄至10岁。犬的用途包括牧犬、看门     

以SPA-ELISA法检测家犬狂犬病抗体的试验

(一)材料与方法1.材料:(1)抗原:为狂犬固定毒CVS株经地鼠肾源代细胞培养提纯的冻干制品,由兰州生物制品研究所提供,批号89004。(2)HRP-SPA:工作浓度1∶100,来源同上,批号89002。(3)阳性血清:家犬经狂犬病弱毒ERA苗加强免疫后采血分离。(4)阴性血清:从非疫区从未注过狂犬疫苗的8个县260只犬采血分离,经酶联免疫试验求平均OD值加两个标准偏差选定。(5)被检血清:免疫后的犬血清及其它病犬血清。(6)其他:邻苯二胺(显色剂),2mol H_2SO_4     

猪瘟中和试验方法研究

作者自1980～1986年间,对猪瘟兔体中和试验方法进行研究,结果显示了一可定性,二可定量;并同步探索出中和价与抗猪瘟强毒成正相关平行线的滴度,为猪瘟免疫防制监测提供了依据。 材料与方法 (一)中和试验用种毒系农牧渔业部成都药械厂生产的猪瘟兔化弱毒淋脾冻干毒(F488、F495代,毒价达2×10~(-4))存-15℃冰箱备用。 (二)攻强毒猪用种毒系农牧渔业部成都药械厂生产用的猪瘟石门系强毒,脱纤冰冻保     

犬腺病毒1型对犬北极狐和银狐的致病性比较

为比较本实验室保存的狐源犬腺病毒1型(CAdV-1)对犬、北极狐和银狐的致病性,以犬、北极狐和银狐为实验动物,建立3组CAdV-1 F1301株的感染模型。攻毒后监测各组动物的临床症状,并计算CAdV-1对这3种动物的半数致死量(LD_(50)),收集感染致死动物的脏器组织,采用病理组织观察、免疫组织化学试验和实时荧光定量PCR等方法比较CAdV-1对犬、北极狐和银狐的致病性。结果显示,3组实验动物均出现神经症状,CAdV-1对犬、北极狐和银狐的LD50分别为106.5T CID50、105.5TCID50和103.0TCID50。病理组织观察和免疫组织化学试验结果显示,3组动物的肝均出现较严重的病理损伤,且均呈CAdV-1强阳性,银狐的脾、北极狐的肺和脾均呈CAdV-1阳性。荧光定量PCR结果显示,3组动物肝中均检测到高拷贝数的病毒DNA,其中银狐肝中的病毒DNA载量高达10~(8.83)copies/g,显著高于北极狐(P0.05)和犬(P0.01),银狐脑组织中的病毒DNA载量也显著高于北极狐(P0.01)和犬(P0.01)。结果表明针对CAdV-1,银狐的易感性大于北极狐,北极狐的易感性大于犬;CAdV-1对3组动物的主要靶器官为肝,银狐的脾和脑以及北极狐的脾和肺也为CAdV-1感染的重要靶器官。本研究为CAdV-1的病理学诊断和综合防控提供了参考。     

猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的安全性及效力试验

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)弱毒株能在Marc-145细胞上正常增殖,经克隆纯化后测得其毒价为107.41TCID50/mL.克隆株对乳鼠、低日龄乳猪和妊娠母猪具有很高的安全性;3日龄乳猪用10-1、10-2稀释的病毒液接种后,能抵御105.8TCID50/mL的PRRS强毒攻击;后备母猪在接种克隆株病毒后于妊娠85 d用PRRS强毒攻击,结果不发生流产;妊娠母猪接种克隆株病毒原液后,足月产仔时其后代无死产、弱仔、干尸化现象.临床应用PRRS弱毒苗12万头份,证明克隆株弱毒苗在控制仔猪呼吸道症状和母猪繁殖障碍方面安全、有效.     

鸡毒支原体强弱毒株LAMP可视化鉴别检测方法的建立

为建立一种能鉴别鸡毒支原体强弱毒株的快速检测方法,根据GenBank中鸡毒支原体S6株的16SrRNA基因序列和F弱毒疫苗株假定的α磷酸海藻糖酶基因序列,设计2套环介导等温扩增引物,建立了鸡毒支原体强弱毒株的环介导等温扩增可视化鉴别检测方法。该方法的敏感性可达10fg,是常规PCR方法的100倍,对其他鸡常见病原体的检测结果均为阴性。全部反应只需一个可控温的水浴锅在1h内即可完成,通过肉眼观察颜色直接判定结果。本研究建立的环介导等温扩增方法简便、快速、灵敏、特异,是一种适于基层工作站的鸡毒支原体强、弱毒株鉴别检测方法。     

犬冠状病毒TN449株M基因的克隆与转移载体的构建

用蔗糖密度梯度离心纯化犬冠状病毒TN449株病毒液,提取总RNA并反转录,同时设计1对5′端加有BamHⅠ和HindⅢ内切酶位点的引物,对病毒cDNA进行了PCR扩增,回收PCR产物将其连接入pGEM-TEasy载体并转化大肠埃希氏菌。并对阳性重组质粒菌测序和序列分析。结果,犬冠状病毒与牛冠状病毒、猫冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、人冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鼠传染性肝炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、人重症急性呼吸道综合征病毒和猪胃肠炎病毒的同源性分别是39.39%、85.41%、83.98%、36.80%、26.64%、37.23%、93.51%、29.00%和94.81%;犬冠状病毒M蛋白有3个疏水性结构域。同时构建了pET28a-CCV-M表达质粒。     

7种动物冠状病毒基因芯片同步检测的研究

根据发布的7种动物冠状病毒相关基因的序列,给每种病毒设计了4~17对引物,同时依据RNA聚合酶基因序列合成了1对兼并引物,利用TCV原毒和纯化浓缩的CCV、FCV、FIPV、TGEV、PRCV、BCV细胞毒,构建了89个基因片段的克隆。采用煮沸裂解法制备质粒DNA,进行特异引物PCR扩增,回收纯化产物,点制冠状病毒基因芯片。抽提病毒总RNA,利用Cy3-dCTP随机渗入反转录PCR标记,同时对BCV、CCV利用Cy3-dCTP随机渗入反转录标记,与芯片进行杂交检测。结果显示,BCV和TCV基因克隆间未见交叉,CCV、FCV、FIPV、TGEV、PRCV则存在广泛交叉。选择无交叉的特异克隆片段点制最终基因芯片,并与病毒多重PCR扩增产物杂交,芯片信号未见交叉,结果判断明确。表明,基因芯片检测法比传统PCR法敏感1 000倍。     

猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的研究--菌种选择、疫苗制备及安全性试验

以国内多发的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 (APP) 1、3、7血清型强毒株作为制苗菌株 ,制成油佐剂三价灭活苗。经效力试验 ,对上述 3种血清型强毒攻击的保护率分别为 88.8%、88.8%和 10 0 % ;试验动物安全性检验及田间安全检验 ,除个别猪出现轻微体温反应及暂时减食外 ,无其他异常反应。表明该苗对猪的保护性及安全性良好     

杆状病毒表达的猪传染性胃肠炎病毒钉状糖蛋白在其血清学诊断上的应用

利用从猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）Ｍｉｌｅｒ株（Ｍ５Ｃ）克隆建立的一株重组杆状病毒（Ｒ２－２）表达的重组ＴＧＥＶ钉状糖蛋白（Ｓ），建立了一种阻断酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）来检测猪群抗ＴＧＥＶ抗体。试验表明，用重组病毒Ｒ２－２接种ｓｆ９细胞（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）所表达的重组蛋白量在接种后第７２ｈ达到最高值；该重组蛋白能与抗ＴＧＥＶＳ蛋白Ａ位点的单克隆抗体特异性结合。用阻断ＥＬＩＳＡ检测６８份来自无ＴＧＥＶ感染或ＴＧＥＶ（Ｐｕｒｄｕｅｌ５）免疫的仔猪或母猪血清，结果与ＴＧＥＶ蚀斑减数试验完全相符，灵敏度和特异性均为１００％。同时检测来自ＴＧＥＶ试验免疫猪、美国部分地区猪群、我国进口猪以及我国国内猪群血清６２７份，阳性检出率分别为８２．６１％、６１．６２％、５８．３３％和２９．１０％；用中和试验（微量中和试验或病毒蚀斑减数试验）检测的ＴＧＥ血清抗体阳性率分别为８０．８７％、５９．６０％、５６．１１％和３０．６０％，两种方法对抗ＴＧＥＶ抗体的检出率没有显著差异。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎W93株活疫苗的研究及其S1基因的克隆与序列测定

利用鸡胚分离法由发生肾病变型传染性支气管炎 (IB)的病鸡分离到嗜肾型传染性支气管炎病毒 (NIBV)W株 ;再通过SPF鸡胚连续传代 ,获得了NIBV疫苗毒株W93;继而借助RT PCR法扩增了其S1基因 ,并测定了S1基因的核苷酸序列 ,分析了与相关毒株间的同源性。结果显示 ,W93株在鸡胚中的病毒产量达 10 7.8EID50 /0 .1mL ,适用于所有日龄的雏鸡 ;W93S1基因的核苷酸序列与马萨诸塞型的M4 1株、H52 株和H12 0 株的同源性很高 ,分别为 96 .9%、96 .8%和 97.1%。表明 ,W93可作为制备IB弱毒疫苗的毒株     

3种基因型鸡传染性支气管炎病毒免疫对tl/CH/LDT3/03株的保护性

以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因比较为基础,分析了IBV tl/CH/LDT3/03型毒株与中国其他流行IBV毒株之间的关系,选择5株代表3种基因型的毒株进行动物免疫攻毒试验,以发病率、死亡率、抗体产生及在不同脏器中的病毒检出率作为指标来评价异种毒株对tl/CH/LDT3/03株的保护性。结果显示,同种致弱毒株对tl/CH/LDT3/03强毒株具有良好的保护性,而异种毒株对tl/CH/LDT3/03强毒株的保护性低。     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果分析

为探讨禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果,利用PCR技术扩增了禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因片段,并克隆入pcDNA3.1(+),构建了DNA疫苗pcDNA-OMPH(pOMPH)、pcDNA-OMPA(pOMPA)和pcDNA-OMPH/OMPA(pOMPHA),将其体外转染SP2/0细胞,用间接免疫荧光试验检测其表达情况。同时以弱毒活疫苗作为阳性对照,pcDNA3.1(+)和PBS作为阴性对照,分别免疫4周龄鸡,检测血清特异性抗体水平、外周血淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况,经强毒攻击后计算各疫苗的保护率。结果显示,融合DNA疫苗组血清抗体水平与弱毒活疫苗相当,明显高于单价DNA疫苗(P<0.05);pOMPHA组的刺激值(SI值)和IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05),单价DNA疫苗组略高于弱毒活疫苗组;强毒攻击后各DNA疫苗均可为动物提供一定的保护力,其中融合DNA疫苗的保护率最高,可达86.7%,其次为弱毒活疫苗,为73.3%,而单价DNA疫苗则低于弱毒活疫苗,仅为60%和66.7%。结果表明,DNA疫苗尤其是融合DNA疫苗在预防禽多杀性巴氏杆菌病(禽霍乱)方面具有较好的应用前景。